Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano

Barreras, Máximo

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano
Autor:	Barreras, Máximo
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Publicación en la Web:	2023-05-09
Fecha de defensa:	2007
Fecha en portada:	2007
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Químicas
Director:	Ielpi, Luis
Idioma:	Español
Palabras clave:	GLICOSILTRANSFERASA; GLUCURONOSILTRANSFERASA; GUMK; EXOPOLISACARIDO; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; XANTANO; POLIPRENOL
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4140_Barreras
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4140_Barreras.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n4140_Barreras
Ubicación:	Dep.QUI 004140
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Barreras, Máximo. (2007). Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4140_Barreras

Resumen:

GumK es una glucuronosiltransferasa de Xanthomonas campestris involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido xantano, siendo la enzima encargada de adicionar el cuarto residuo de azúcar en la síntesis de la unidad repetitiva pentasacarídica de este polímero. Específicamente, GumK transfiere un residuo de ácido glucurónico a partir de su sustrato dador UDP-GlcA a su sustrato glicolipídico aceptor, polisoprenil-pirofosfato-glucosa-β-1,4-glucosa-α-1,3-manosa. Se caracterizó funcional y estructuralmente a GumK. La caracterización funcional se dio mediante la sobrexpresión, purificado y ensayos de actividad in vitro e in vivo de la enzima. Mediante estos ensayos de actividad se estudió la especificidad por sus sustratos. Asimismo se estudió su localización subcelular mediante fraccionamiento y detección por western blots. Al determinarse que esta enzima esta asociada a membranas, se realizaron experimentos de disociación para determinar el modo de unión a la membrana. Encontramos que interacciones hidrofóbicas y electrostáticas están involucradas en esta interacción. La caracterización estructural involucró la cristalización, colección de datos de difracción de rayos-X y resolución de la estructura de la proteína. La estructura fue resuelta con la información de fases proveniente de un experimento de dispersión anómala múltiple sobre un derivado de GumK con átomos de platino. La proteína mostró una estructura consistente de 2 dominios globulares tipo Rossmann, con una hendidura central que es el sitio de unión de sus sustratos y donde ocurre la catálisis. Además, y mediante experimentos de inmersión de cristales, logramos observar y describir el sitio y las interacciones que median la unión de la porción nucleotídica (UDP) del sustrato dador en la enzima. Para confirmar el rol de los residuos involucrados en la unión del UDP, realizamos mutagénesis sitio-dirigida y análisis de la cinética enzimática de las proteínas mutadas. Además realizamos estudios de complementación in vivo con estas mutantes. Estos análisis nos permitieron confirmar el rol de al menos media docena de residuos involucrados en la unión del sustrato dador y postular al aspartato 157 como un posible aminoácido catalítico.

Abstract:

GumK is a glucuronosyltransferase from Xanthomonas campestris involved in xanthan biosynthesis. This enzyme is responsible for the addition of the fourth sugar residue in xanthan pentasaccharidic subunit. Specifically, GumK transfers a glucuronic acid residue from the donor substrate UDP-GlcA to the acceptor, poliprenil-diphosphate-glucose-β-1,4-glucose-α-1,3-mannose. GumK was functional and structurally characterized. Functional characterization of GumK was performed through overexpression, purification and in vivo/in vitro enzymatic assays. Substrate specificity was studied with these in vitro assays. Subcellular location was studied with cell fractioning, differential centrifugation and detection with western blots. Dissociating treatments from the membrane fraction were carried out to study the specific type of interaction with the membrane. We found that hydrophobic as well as electrostatic interactions were involved in membrane binding. Structural characterization was performed after crystallization and X-ray data diffraction collection of GumK crystals. The final structure was solved with phase information obtained from a multiple anomalous diffraction experiment carried out on a platinum derivative crystal. The enzyme showed a structure consisting of two Rossmann-fold domains separated by a deep cleft where substrates bind and catalysis occurs. Furthermore, by performing crystal soaking experiments we were able to find and describe the position of the nucleotide portion (UDP) of the donor substrate and the interactions that stabilize the binding of this substrate. To confirm the role of those residues involved in UDP binding we performed site-specific mutagenesis, kinetic characterization and in vivo complementation experiments on these mutants. These experiments allowed us to confirm the role of at least half a dozen residues involved in substrate binding and to postulate aspartic acid 157 as the catalytic residue.

Citación:

---------- APA ----------

Barreras, Máximo. (2007). Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4140_Barreras

---------- CHICAGO ----------

Barreras, Máximo. "Estudios de Función y estructura en GumK, una glucuronosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del xantano". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2007.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4140_Barreras

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