Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Estudios moleculares de la relación hospedante-patógeno : resistencia mediada por la cápside heteróloga y homóloga; relación entre microRNAs, supresores de silenciamientos, generación de síntomas y malformaciones |
| Título alternativo: | Molecular host-pathogen studies: heterologous and homologous coat protein mediated resistance; relationship between microRNAs, silencing suppressors, symptoms severity and plant development |
| Autor: | Bazzini, Ariel A. |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2007 |
| Fecha en portada: | 2007 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Asurmendi, Sebastián |
| Consejero: | Hopp, Horacio Esteban |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | RESISTENCIA MEDIADA POR CAPSIDE VIRAL; PVX; TMV; MICRORNA; SILENCIAMIENTOCOAT PROTEIN MEDIATED RESISTANCE; PVX; TMV; MICRORNA; SILENCING |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4132_Bazzini |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4132_Bazzini.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n4132_Bazzini |
| Ubicación: | BIO 004132 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Bazzini, Ariel A.. (2007). Estudios moleculares de la relación hospedante-patógeno : resistencia mediada por la cápside heteróloga y homóloga; relación entre microRNAs, supresores de silenciamientos, generación de síntomas y malformaciones. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4132_Bazzini |
Resumen:
Las enfermedades provocadas por virosis provocan grandes pérdidas de producción en las especies cultivables, es por esto que la búsqueda de resistencia genética es de alta prioridad para los mejoradores vegetales y de gran importancia para nuestro país. El objetivo de este trabajo fue profundizar en el conocimiento de las bases moleculares de la interacción hospedante-patógeno teniendo como meta futura el diseño de nuevas estrategias de control de virosis. Para ello se estudiaron distintos tipos de mecanismos involucrados en la defensa a virus mediados por transgenes. El trabajo fue dividido en 5 capítulos. En el primero se demuestra que la expresión transgénica de la cápside (CP) del virus del mosaico del tabaco (TMV) en cultivos celulares o en plantas, reduce la tasa de replicación, la acumulación viral y el movimiento célula a célula del virus X de la papa (PVX). A esta clase de resistencia se la conoce como resistencia mediada por CP (CP-MR), y como en este caso interfiere con un virus distinto a la CP expresada se lo denominó CP-MR heteróloga. Utilizando genes recombinantes codificantes para CPs de TMV mutadas puntualmente que confieren características estructurales diferentes, que modifican por ejemplo los niveles agregación, se demostró que al variar estas características se observan cambios de CP-MR heteróloga, en correspondencia con lo previamente observado en CP-MR homóloga. Estos resultados sugieren que, de esta manera, se puede mejorar artificialmente el sistema de protección. Los experimentos inversos, expresando la CP de PVX e infectando con TMV, demostraron los mismos efectos, sugiriendo que para ambos casos la CP-MR heteróloga tiene mecanismos similares. En esta tesis se plantean tres modelos para explicar el funcionamiento de la denominada CP-MR heteróloga. El segundo capítulo demuestra que el silenciamiento génico no juega un rol importante en la CP-MR homóloga en el caso de PVX. No se detectó una disminución en el grado de resistencia a PVX en plantas expresando la CP de PVX tanto pre-infectadas con el virus Y de la papa (portador de un supresor fuerte de silenciamiento), como en plantas crecidas a bajas temperaturas (considerando que las bajas temperaturas inhiben el silenciamiento). Tampoco se registró una disminución en la acumulación del RNA mensajero de la CP transgénica de PVX en plantas inoculadas con PVX como posible resultado del silenciamiento inducido por el PVX. Estos datos en conjunto con los del primer capítulo son indicios importantes que permiten pensar que el desarrollo de una resistencia viral de amplio espectro basada en la expresión de CP es posible y por lo tanto, vale la pena desarrollarla. En el tercer capítulo se muestra que la co-expresión de la proteína de movimiento (MP) y la CP de TMV en plantas transgénicas de tabaco producen serios problemas en el desarrollo. En estas plantas al igual que en plantas no transgénicas infectadas con TMV se detectó un aumento en la acumulación de microRNAs (miRNA), sugiriendo que esta alteración podía causar tanto los problemas morfológicos de las plantas transgénicas como los síntomas de las plantas infectadas. Asimismo, se evidenció mediante experimentos de complementación de fluorescencia (BiFC) que la MP y CP interaccionan in vivo y a su vez que la co-expresión no suprime el silenciamiento génico local ni sistémico. Este es el primer trabajo donde se muestra que tanto proteínas virales como virus sin capacidad de suprimir silenciamiento alteran la ruta de los miRNAs apoyando la hipótesis de un importante rol para los miRNAs en la interacción virus-planta. En el cuarto capítulo se evidencia que la actividad supresora del silenciamiento viral no es necesaria para alterar la acumulación de miRNAs durante la infección. También se mostró una correlación entre la capacidad de alterar la acumulación de miRNAs y la severidad de los síntomas. Este capítulo junto al anterior apoyan fuertemente la existencia de una relación entre algunos miRNAs y las alteraciones morfológicas similares a síntomas. A su vez, estos datos sugieren un rol de los miRNAs en la interacción entre el virus y las plantas. La información obtenida propone continuar estudiando estos fenómenos para poder desarrollar nuevas estrategias para conferir resistencia o controlar la sintomatología de las infecciones virales. En el último capítulo se describe la utilización de un miRNA sintético. Se diseñó un miRNA a partir del esqueleto del miR164 de Arabidopsis para reconocer al RNA mensajero de la proteína verde fluorescente. Se confirmó su actividad sobre el gen deseado in vivo mostrando que los miRNAs pueden ser utilizados como herramienta molecular para regular negativamente la acumulación de un RNA mensajero determinado y así controlar su expresión.
Abstract:
Viral infections cause significant economic losses in crops; therefore, it is extremely important to look for new genetic ways to confer resistance in these crops. The goal of this thesis is to understand the molecular bases of the host-pathogen interaction; specially focusing in the development of novel strategies to control viral infection. Hence, different mechanisms to confer viral resistance mediated by transgenes were studied. The work was divided in five chapters. In the first one, it was demonstrated that transgenic expression of tobacco mosaic virus (TMV) coat protein (CP) in plant cells cultures as well as in plants reduces the replication and cell to cell movement of the potato virus X (PVX). This class of resistance is named coat protein mediated resistance (CP-MR). When the CP of one virus confers resistance to another virus it is called heterologous CP-MR. Using TMV CP mutants, with particular structural characteristics, we demonstrated that the level of aggregation is important to produce heterologous CP-MR, same results were previously reported for homologous CP-MR. Consequently, these results suggest that mutations in the CP can be used to enhance the heterologous protection. In addition, expression of PVX CP also interfered with TMV accumulation and cell to cell movement. So, both heterologous CP-MR seems to work in similar ways. Three different hypotheses are discussed to explain this process. In the second chapter it is shown that post transcriptional gene silencing (PTGS) does not play an important role in the homologous PVX CP-MR. No PVX resistance reduction was detected in transgenic tobacco plants expressing the CP of PVX either previously infected with the potato virus Y (carries a strong PTGS suppressor) or infected at low temperatures (PTGS is inhibited by low temperatures). Moreover, no reduction of the transgenic PVX CP RNA messenger level was detected after infection with PVX. In conclusion, these results showed that the PTGS is not a significant player on the PVX CP-MR mechanism. The third chapter demonstrates that co-expression of TMV movement protein (MP) and CP in transgenic plants cause developmental problems. In the co-expressing line and in TMV infected plants, microRNAs (miRNA) levels are increased, suggesting that the miRNAs alteration could be the cause of the developmental abnormalities in the transgenic plants and the symptoms of the infected plants. Evidence of interaction of the MP with the CP in vivo was shown by bimolecular fluorescent complementation (BiFC) assays. The MP and/or CP expression could not suppress the systemic or local PTGS. Therefore, this is the first study showing that viral proteins with no PTGS suppression activity alter miRNA accumulation. Thus, these results support the idea of an important role of the miRNA pathway in the virus- plant interaction. Chapter four confirms that viral PTGS suppression activity in not essential to alter miRNAs accumulation during viral infections. Furthermore a correlation between miRNA alteration and symptoms severity was found, suggesting links between miRNA alteration and developmental changes or viral symptoms. In agreement with the previous chapter, these results also support the hypothesis that miRNAs is an active player of the host-pathogen interaction. In the last chapter, a proof concept of artificial miRNA potential applications is described. miRNA164a from Arabidopsis thaliana was used as a backbone, to design an artificial miRNA, meant to recognize the mRNA of the green fluorescent protein (GFP). The correct miRNA processing and activity in vivo was confirmed by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana leaves. The artificial miRNA reduced the accumulation of the GFP mRNA and consequently reduced the fluorescence. Hence, an artificial miRNA could be used to control the expression of candidate genes in different organisms.
Citación:
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Bazzini, Ariel A.. (2007). Estudios moleculares de la relación hospedante-patógeno : resistencia mediada por la cápside heteróloga y homóloga; relación entre microRNAs, supresores de silenciamientos, generación de síntomas y malformaciones. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4132_Bazzini
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Bazzini, Ariel A.. "Estudios moleculares de la relación hospedante-patógeno : resistencia mediada por la cápside heteróloga y homóloga; relación entre microRNAs, supresores de silenciamientos, generación de síntomas y malformaciones". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2007.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4132_Bazzini
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