Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas

Spagnuolo, Carla Cecilia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas
Autor:	Spagnuolo, Carla Cecilia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Publicación en la Web:	2023-05-09
Fecha de defensa:	2007
Fecha en portada:	2007
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Químicas
Idioma:	Español
Palabras clave:	SONDAS BIARSENICADAS; FLUOROFORO; PCFRET; NANOPARTICULAS; TIOESTERBISARSENICALS PROBES; FLUOROPHORES; PCFRET; NANOPARTICLES; THIOESTER
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4059_Spagnuolo
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4059_Spagnuolo.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n4059_Spagnuolo
Ubicación:	Dep.QUI 004059
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Spagnuolo, Carla Cecilia. (2007). Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4059_Spagnuolo

Resumen:

Esta Tesis comprende dos objetivos fundamentales: uno es el desarrollo de sondas fluorescentes para marcación específica de proteínas y el segundo es el control de las propiedades ópticas de nanopartículas luminiscentes para lograr la detección específica de biomoléculas de interés y su seguimiento en el tiempo por microscopía de fluorescencia. El desarrollo de sondas para marcación específica se llevó adelante por dos estrategias: una involucró compuestos biarsenicados y la segunda la síntesis de compuestos con grupos tioéster. Se prepararon dos nuevas sondas de la familia de los fluoresceinditioarseniatos (FlAsH), con propiedades espectroscópicas mejoradas en comparación con las previamente descriptas, destinadas a su aplicación en la metodología sonda biarsenicada-motivo tetracisteína. Como parte del diseño de estas sondas, se estudió la fotoquímica de los fluoróforos precursores con espectrometría UV-vis y fotólisis de destello. Se realizó una completa caracterización espectroscópica de los complejos sonda-péptido así como también se estudió la cinética de la reacción de marcación in vitro en un sistema modelo y se analizó la fotoestabilidad del mismo. Por otra parte, se estudió la eficiencia de estos compuestos como donantes del proceso de transferencia de energía con aceptores fotocrómicos (pcFRET) y se evaluó la marcación específica en distintos sistemas in vivo, a través de técnicas de microscopía de fluorescencia en estado estacionario y con resolución temporal (FLIM). Se obtuvieron también distintas sondas derivadas de tioésteres para su aplicación en la metodología de marcación que utiliza la reacción de unión química nativa (NCLR, native chemical ligation reaction). Se estudió la viabilidad de la marcación in vitro por esta técnica utilizando un péptido modelo. La aplicación de estos compuestos en un sistema in vivo permitió evaluar esta estrategia de marcación específica por primera vez en células eucariotas vivas. Por último, se trabajó en el control de las propiedades ópticas de las nanopartículas fluorescentes Quantum dots, con la metodología de pcFRET. Se obtuvieron resultados exitosos en los experimentos por espectroscopía así como también, por microscopía.

Abstract:

This Thesis concerns the development of luminiscent probes for specific targeting of proteins and for time resolved tracking of biomolecules in the fluorescence microscope.The first group of probes was based on two strategies, namely bisarsenical derivatives of fluorescein and thioester fluorophores. The second group involved the modulation of the luminescence of Quantum dots with photochromic acceptors for FRET. Two novel probes from the dithioarsenatefluorescein (FlAsH) family were prepared, resulting in improved spectroscopic properties as compared with previously reported compounds. A spectroscopic characterization of the peptide-probe complex was developed, as well as, a kinetic and photostability study of the reaction involved in the in vitro labelling of a model system. On the other hand, the efficiency of these compounds as pcFRET donors was studied in acceptor-donor pairs involving diheteroarylethenes developed in our laboratory. Specific labelling of different in vivo systems was studied with these molecules through steady-state and time-resolved fluorescence microscopy (FLIM). The photochemistry of the parent fluorophores was characterized through UV-vis spectroscopy and flash photolysis techniques. Different thioester based probes were also prepared for their application in NCLR (native chemical ligation reaction) labelling. In vitro labelling viability was tested by using a model peptide. For the first time, in vivo labelling in eucariotic cells was performed with these probes. Finally, modulation of the optical properties of semiconductor nanoparticles (Quantum Dots) was performed by attaching photochromic compounds to the polymeric surface of the nanoparticles and carrying out pcFRET experiments. Modulation of the emission was succesfully observed by spectroscopy and microscopy.

Citación:

---------- APA ----------

Spagnuolo, Carla Cecilia. (2007). Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4059_Spagnuolo

---------- CHICAGO ----------

Spagnuolo, Carla Cecilia. "Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2007.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4059_Spagnuolo

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