Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Identificación y caracterización de Mce3R, un regulador negativo de la transcripción del operón mce3 de Mycobacterium tuberculosis |
| Autor: | Santangelo, María de la Paz |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2006 |
| Fecha en portada: | 2006 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Bigi, Fabiana |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | M. TUBERCULOSIS; MCE; TETR; REGULACION; VIRULENCIAM. TUBERCULOSIS; MCE; TETR; REGULATION; VIRULENCE |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4010_Santangelo |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4010_Santangelo.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n4010_Santangelo |
| Ubicación: | Dep.BIO 004010 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Santangelo, María de la Paz. (2006). Identificación y caracterización de Mce3R, un regulador negativo de la transcripción del operón mce3 de Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4010_Santangelo |
Resumen:
La Tuberculosis (TB) es una de las enfermedades infecciosas más antiguas y a pesar de la existencia de una vacuna Bacille Calmette-Guérin (BCG) y de un tratamiento con antibióticos, un tercio de la población mundial está infectada con Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la TB. Aproximadamente ocho millones de nuevos casos son diagnosticados anualmente y la tasa de mortalidad es de dos millones por año (World Health Organization, 2002). A partir del análisis de la secuencia del genoma de M. tuberculosis, se identificaron cuatro regiones genómicas homólogas denominadas operones mce (por mammalian cell entry) 1, 2, 3 y 4 (Cole et al., 1998). Codifican para ocho proteínas secretadas o de membrana, similares en secuencia y organización y con una alta homología entre ellos. La proteína con características de invasina descripta por Riley y colaboradores es la denominada Mce1A (Arruda et al., 1993). Hacia el extremo 5’ de la unidad transcripcional, se encuentran los dos genes yrbE A y B que codifican para proteínas integrales de membrana. Los seis genes siguientes de cada operón (mceA-F), están relacionados y poseen motivos conservados y una organización común. Estos operones se encuentran ampliamente distribuidos en el género y su presencia fue demostrada en especies micobacterianas no tuberculosas MOTT (Mycobacterium other than tuberculosis), incluyendo M. avium y M. smegmatis (Haile et al. 2002). La presencia de los operones mce en M. smegmatis una cepa saprofítica, parecería indicar que la presencia o ausencia no se correlaciona con patogenicidad, pero una diferencia en los perfiles de expresión sí podría tener importancia en las micobacterias patógenas. Por otro lado, cuando se bloquea la expresión de algunos genes mce en M. tuberculosis, el bacilo pierde capacidad de multiplicar y persistir in vivo con una disminución en las UFC en bazo y pulmón de ratón (Gioffré et al., 2005). Kumar y colaboradores (2003) demostraron que la expresión de los operones mce varía espacial y temporalmente. La presencia de genes reguladores en las cercanías de tres de los cuatro operones Rv0165c del operón mce1, Rv0586 del operón mce2 y Rv1963c del operón mce3, indicaría que existe un mecanismo que controla el nivel de expresión de los genes mce y que el mismo podría ser la clave que determina la asociación de los operones mce con la virulencia de las micobacterias patógenas. Adyacente a los genes Rv1964- Rv1971, que conforman el operón mce3, y en sentido contrario al de la transcripción se encuentra Rv1963c (Mce3R) que codifica para un putativo regulador transcripcional de la familia TetR. Ya que los reguladores transcripcionales suelen regular la expresión de genes cercanos, fue de interés en este trabajo estudiar el rol de dicho gen en la regulación de la expresión del operón mce3. Los experimentos de geles de retardo realizados con diferentes sondas evidenciaron una unión específica de la proteína que codifica Rv1963c (Mce3R) al promotor del operón mce3, P3-200. Más consistentemente, los ensayos de regulación utilizando el gen lacZ como reportero en las cepas de M. smegmatis y M. tuberculosis, mostraron que la actividad promotora de P3 es mucho menor en presencia de la proteína Mce3R que en ausencia de la misma. Y por último, la eliminación de mce3R en M. tuberculosis (Δmce3R), resultó en un incremento significativo en el nivel de mRNA del operón mce3. Por lo tanto es posible concluir que Mce3R regula negativamente la transcripción del operón mce3 por unión a la región promotora. Dicha región fue definida dentro de las 206pb (P3-200) ubicadas río arriba del codón de iniciación del gen Rv1964 mediante deleciones de la región intergénica y determinación de la actividad promotora por fusión a β-galactosidasa. En la misma región P3-200 se identificó mediante geles de retardo, footprinting, mutagénesis dirigida y el uso del gen reportero la región operadora tetO’ a la que se une Mce3R y se definió el consenso tet al que se une en M. tuberculosis. A partir del mismo fue posible predecir otros genes putativos blancos de Mce3R y proponer una posible función para los genes mce. El alto grado de conservación entre los genes mce plantea la posibilidad de que Mce3R actúe regulando la expresión de los operones mce1, 2 y 4. En este trabajo se determinó mediante la utilización de un reportero y QRT-PCR que Mce3R no regula los otros operones en las condiciones estudiadas. Por otro lado la mutante obtenida en el gen mce3R (Δmce3R) abre el camino hacia la exploración de este sistema de regulación mediante el empleo de tecnologías de genómica funcional. Finalmente, se ha estudiado y caracterizado un sistema de expresión inducible que podrá ser usado como herramienta en el estudio de regulación y función de genes y la obtención de mutantes condicionales.
Abstract:
Tuberculosis (TB) is one of the most antiques infectious diseases and despite the availability of effective short-course chemotherapy (DOTS) and the Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine, one third of the world population is infected with Mycobacterium tuberculosis the etiological agent of TB. At the present time, the World Health Organization (WHO) estimates that eight million new cases of tuberculosis occur every year and the death rate due to this disease is about two million people every year (WHO, 2002). From the complete genome sequence of Mycobacterium tuberculosis Cole et al. (1998) identified four genomic regions called mce (for mammalian cell entry) 1, 2, 3 y 4. They encode secreted or exported proteins. The ORFs within the region are organized as a putative operon, and they are similar in its sequence and organization. Mce1A is the highly homologous to the invasin-like proteins described by Riley and colleagues (Arruda et al.1993). The first two genes yrbA and B encoded for integral membrane proteins. The six mceA-F are highly related and have conserved motives and a common organization. These operons are broadly distributed in the genera and their presence was demonstrated in MOTT (Mycobacterium other than tuberculosis), including M. avium and M. smegmatis (Haile et al. 2002). Even though the presence of mce operons in Mycobacterium smegmatis, which is a saprophytic species, suggests that the presence or absence of mce operons does not correlate with pathogenicity. It is possible that its expression profile plays a key role in the virulence of pathogenic mycobacteria. On the other hand, mutation in the mce genes affected the in vivo growth of M. tuberculosis as assessed by reduction of colony-forming units in the lungs and spleen of mice (Gioffré et al., 2005). It was demonstrated that there is a temporal and growth phase specific difference in expression of mce operons (Kumar et al 2003). The presence of regulatory genes in the vicinity of three of the four mce operons: Rv0165c upstream of mce1, Rv0586 of mce2 and Rv1963c of mce3 suggests the presence of regulatory mechanisms that controls the level of expression of the mce genes and that this could be the key in the association of mce operons with virulence in pathogenic mycobacteria. The gene Rv1963c located upstream and divergently transcribed from the Rv1964- Rv1971 genes which are part of mce3 operon is predicted to encode a TetR family transcriptional regulator (TubercuList). Since prokaryotic regulators are frequently located adjacent to genes under their control, we hypothesized that this gene encoded a regulator of the mce3 operon (designated mce3R). In order to investigate the role of Mce3R in the regulation of the mce3 operon, the Mce3R protein was examined for its ability to bind to the mce3 promoter (P3-200) region by performing a gel-shift assay. Furthermore, using lacZ as a reporter we found that b-Galactosidase activity was much lower in M.smegmatis mc2155 or M. tuberculosis in the presence of Mce3R (P3-mce3R) than in its absence (P3). Finally, disruption of mce3R (Δmce3R) resulted in upregulation of mce3 genes in the mce3R mutant vs wild-type M. tuberculosis and H37Rv strain assessed by RT-qPCR. These data confirm that Mce3R negatively regulates mce3 operon by binding to the P3-200 promoter region. In the same region, we identified the tetO’ motif recognized by Mce3R performing different methodologies: gel shift, footprinting, directed mutagenesis and β-galactosidasa assays. We also predicted with bioinformatics tools other targets of Mce3R and we suggested a putative function for the mce genes. The high conservation among mce genes prompted us to evaluate the role of Mce3R in the regulation of the four mce operons. Performing β- galactosidasa assays and RT-qPCR we demonstrated that Mce3R do not regulate mce1, 2 and 4 operons. The generation of a mutant strain Δmce3R will be useful for future research evaluating this regulatory mechanism using functional genomic tools. We report the development of a mycobacterial gene regulation system that allows controlling gene expression that can be used to construct conditional knockouts and to analyze the function of essential mycobacterial genes.
Citación:
---------- APA ----------
Santangelo, María de la Paz. (2006). Identificación y caracterización de Mce3R, un regulador negativo de la transcripción del operón mce3 de Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4010_Santangelo
---------- CHICAGO ----------
Santangelo, María de la Paz. "Identificación y caracterización de Mce3R, un regulador negativo de la transcripción del operón mce3 de Mycobacterium tuberculosis". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2006.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4010_Santangelo
Estadísticas:
Descargas totales desde :
Descargas mensuales
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n4010_Santangelo.pdf
