Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos |
| Título alternativo: | Development of virus like particles (VLPs) based on VP6 protein of rotavirus as presentation system for heterologous epitopes |
| Autor: | Peralta, Andrea |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología
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| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2006 |
| Fecha en portada: | 2006 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Taboga, Oscar |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3935_Peralta |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3935_Peralta.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3935_Peralta |
| Ubicación: | Dep.BIO 003935 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Peralta, Andrea. (2006). Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3935_Peralta |
Resumen:
En este trabajo de tesis se ha ensayado la presentación de secuencias aminoacídicas heterólogas en la superficie de partículas semejantes a virus derivadas de la proteína VP6 de rotavirus para usos biotecnológicos. Para esto, se seleccionaron nueve sitios de inserción en la proteína VP6, que corresponden a las posiciones aminoacídicas 1,14, 101, 146, 171, 235, 301/308, 358, y 382 mediante algoritmos que predicen hidrofilicidad y antigenicidad, así como a partir de datos cristalográficos. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior de un epitope de 14 aminoácidos derivado del paramixovirus SV5, originando así las distintas versiones VP6-V5. De las distintas quimeras expresadas en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes se determinaron los niveles de expresión alcanzados, su capacidad de trimerización, su capacidad de multimerización, sus propiedades antigénicas, su interacción con la proteína VP2 y su inmunogenicidad en animales de laboratorio. La inserción del epitope V5 en las posiciones 171, 235 y 301/8 impidió la formación de trímeros, mientras que la inserción de la secuencia heteróloga en las posiciones 358 y 382 afectó seriamente la capacidad de multimerizar, lo que no pudo ser revertido por la coexpresión de la proteína VP2, que estabiliza las estructuras multiméricas. Los resultados obtenidos aportan datos que ayudan a caracterizar con mayor precisión los dominios de trimerización y de multimerización de la proteína VP6, acotando el dominio de trimerización a los aminoácidos 171 y 328 y el de multimerización, a los aminoácidos 315 a 397. Por otro lado, la versión VP6/V514 no fue reconocida por distintos sueros policlonales anti-VP6, mientras que sí lo fue por un anticuerpo monoclonal anti-V5, indicando que mediante la inserción de una secuencia en esta posición se interrumpe el sitio antigénico lineal inmunodominante de la proteína VP6. La caracterización estructural de los multímeros VP6/V5 mediante gradientes de CsCl, microscopía electrónica y ensayos de ELISA sandwich reveló que la inserción del epitope V5 en la posición 171 de VP6 produce las VLPs quiméricas más estables y que exponen el epitope heterólogo en su superficie. La inmunización de ratones con la mayoría de las quimeras VP6/V5 en su estado monomérico resultó en la inducción de una sólida respuesta humoral contra el epitope V5, que dependió de la posición de éste en la proteína carrier y que se mantuvo constante hasta los 150 días de iniciado el experimento. Un resultado similar se obtuvo cuando se inmunizaron ratones con las quimeras VP6/V5 en estado multimérico, en particular, con la versión VP6/V514. En este caso, es notable remarcar que se obtuvo una sólida respuesta humoral contra el epitope V5 aún utilizando sólo 30 ng de proteína quimérica como inmunógeno, lo que equivale a utilizar 0,9 ng de péptido V5. Se puede concluir que los resultados obtenidos en este trabajo de tesis aportan valiosos datos a la caracterización antigénica y estructural de la proteína VP6 de rotavirus, los que permitieron identificar sitios de inserción de secuencias heterólogas que pueden utilizarse en la producción de VLPs quiméricas capaces de inducir sólidas respuestas inmunes humorales contra el epitope transportado, a dosis muy bajas.
Abstract:
The presentation of heterologous amino acid sequences on the surfaces of viruslike particles derived from rotavirus VP6 protein as a technological tool has been studied in this work. Nine inserion sites in the VP6 sequence have been selected corresponding to amino acids 1,14, 101, 146, 171, 235, 301/308, 358, and 382 on the basis of their profiles of antigenicity, hydrophilicity and christallographic data. By using site-directed PCR mutagenesis, single XbaI sites were incorporated in the VP6 sequence followed by cloning of a synthetic duplex coding for a 14 amino acid epitope derived from paramyxovirus SV5, giving rise to the different mutants VP6- V5. After expression of the VP6-V5 chimeras in insect cells infected with recombinant baculoviruses, the expression levels as well as their ability to trimerize, multimerize, interact with VP2, their antigenic properties and immunogenicity in laboratory animals were evaluated. Insertion of V5 epitope at positions 171, 235 and 301/8 abolished the ability to form trimers, while insertion at positions 358 and 382 drastically affected the ability to form multimers. This fact could not be reverted by coexpression of VP2, a protein of the rotavirus core that stabilizes multimeric structures. The results obtained in this work are useful to more precisely characterize the domains involved in trimer and multimer formation, restricting the trimerization domain to amino acids 171 to 328 and the multimerization domain to amino acids 315 to 397. On the other hand, the monomeric form of VP6/V514 could not be recognized by sera from different species, whereas a monoclonal anti-V5 antibody did recocnize it, indicating that the insertion interrupted the major linear antigenic site in VP6. A structural characterization of the different chimeras employing ultracentrifugation in CsCl gradients, electron microscopy and sandwitch ELISA revealed that insertion of V5 at 171 produced the more stable chimeras, displaying the foreign epitope on their surface. Immunization of mice with most of the monomeric chimeras elicited a solid humoral immune reponse, exhibiting dependence on the insertion site in the carrier protein. Antibody titers after two doses persisted until 150 days after the first innoculation. Similar results were obtained when mice were immunizated with multimeric chimeras, using as little as 30 ng of VLPs, comprising 0.9 ng of V5 peptide. In conclussion, the results obtained in this work yielded valuable data on the structural and antigenic issues of rotavirusVP6 protein, and allowed the identification of precise sites for the insertion of foreign sequences that can be used in the production of chimeric VLPs able to induce solid humoral responses against the transported epitope at very low doses.
Citación:
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Peralta, Andrea. (2006). Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3935_Peralta
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Peralta, Andrea. "Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2006.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3935_Peralta
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