Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Caracterización de la proteína Hsp90 y co-chaperonas de Toxoplasma gondii y su papel en el desarrollo del parásito |
| Título alternativo: | Characterization of Toxoplasma gondii Hsp90 and co-chaperones and their involment during parasite development |
| Autor: | Echeverría, Pablo C. |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2006 |
| Fecha en portada: | 2006 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Angel, Sergio Oscar |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | TOXOPLASMA; PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO; HSP90; LOCALIZACION NUCLEAR; DESARROLLO; CO-CHAPERONASHEAT SHOCK PROTEINS; NUCLEAR LOCALIZATION; DEVELOPMENT; CO-CHAPERONES |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3917_Echeverria |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3917_Echeverria.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3917_Echeverria |
| Ubicación: | Dep.BIO 003917 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Echeverría, Pablo C.. (2006). Caracterización de la proteína Hsp90 y co-chaperonas de Toxoplasma gondii y su papel en el desarrollo del parásito. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3917_Echeverria |
Resumen:
Toxoplasma gondii es una parásito intracelular obligado y un patógeno humano de importancia. Dos formas replicativas son la característica principal del ciclo asexual de éste parásito: uno de replicación rápida (el taquizoito) y otro de división lenta (los bradizoitos enquistados). El proceso que permite la interconversión entre taquizoitos y bradizoitos es central para la patogenicidad y duración de la infección. Todavía no están claramente comprendidos los mecanismos que regulan este proceso de diferenciación. La inducción del desarrollo del estadío bradizoito in vitro se asocia con varios tipos de estresores, estímulos que son conocidos también como inductores de la expresión de proteínas de choque térmico (HSPs). Las HSPs son un enorme grupo de proteínas que se asocian en forma transiente con intermediarios de plegado de proteínas nacientes o también con proteínas desnaturalizadas, con el objeto de evitar la agregación. In vivo, la proteína Hsp90 tiene un rol fundamental en la maduración de componentes de numerosas vías de transducción de señales. El objetivo de esta tesis fue identificar factores asociados con la diferenciación del parásito. Nuestros estudios se centraron en el análisis del perfil de expresión y la regulación durante el desarrollo de la proteína Hsp90 de T. gondii en tres tipos de parásitos, la cepa RH ΔUPRT, la cepa cistogénica ME49 y un clon derivado de esta última, PK todas útiles para estudios de diferenciación in vitro. Nuestros resultados muestran que el transcripto y nivel proteico de Hsp90 se ven incrementados ante condiciones de estrés y de diferenciación del parásito a bradizoíto. Estudios de microscopía confocal e inmunofluorescencia revelaron que la proteína Hsp90 está presente en el citoplasma de taquizoitos y en el citoplasma y núcleo de bradizoitos maduros, lo cual, sugiere una correlación entre la localización subcelular y los dos estadios asexuales de desarrollo. Para caracterizar el papel de la proteína Hsp90 en la diferenciación a bradizoíto, se estudiaron mutantes de T. gondii incapaces de desarrollar a bradizoitos. Bajo condiciones de diferenciación a bradizoitos éstos parásitos mostraron un patrón de localización celular equivalente al observado en taquizoitos. Se utilizó una droga capaz de unirse e inhibir la función de Hsp90, la geldanamicina, la cual, bloqueó la conversión de taquizoito a bradizoíto y también el camino inverso. Estos resultados sugieren un papel crucial para la proteína Hsp90 durante el cambio de estadío. Se sabe, a partir de estudios realizados sobre la maduración de los receptores de esteroides, que la proteína Hsp90 no actúa sola, sino, que lo hace en asociación con variadas co-chaperonas (Hip, Hsp40, Hop, P23). Estas proteínas se unen a la proteína Hsp90 y se organizan en sub-complejos discretos, cada uno conteniendo un grupo diferencial de co-chaperonas. En el genoma de T. gondii pudimos encontrar varias co-chaperonas pertenecientes a la extensivamente estudiada, “maquinaria” chaperona de las proteínas Hsp90/Hsp70. Se clonaron las proteínas Hip y P23, las cuales, una vez expresadas nos permitieron obtener anticuerpos policlonales que las reconozcan. Por ensayos de co-inmunoprecipitación se pudo determinar que Hip y P23 interactúan con la proteína Hsp90. Ambas co-chaperonas colocalizan intracelularmente con Hsp90 en el estadío taquizoito. En el estadío bradizoito solamente P23 colocaliza con Hsp90, manteniéndose Hip excluida del núcleo. También se clonaron y caracterizaron preliminarmente las co-chaperonas Hop y Hsp40.
Abstract:
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite and an important human pathogen. Two replicative forms characterize the asexual cycle of the protozoan parasite Toxoplasma gondii: rapidly growing tachyzoites and slowly dividing encysted bradyzoites. This process of tachyzoite–bradyzoite interconversion is central to the pathogenesis and longevity of infection. The mechanisms that regulate the transition between these two stages are not clearly understood. However, stress inducers that also activate heat shock protein expression can trigger formation of bradyzoites in vitro. A large and diverse group of proteins, known as chaperones, transiently associate with protein folding intermediates or proteins needing to be refolded after stress, to prevent aggregation, but in many cases the specific functions of individual chaperones are no still clear. In vivo, Hsp90 (heat shock protein 90) plays a key role in the maturation of components of signal transduction pathways. In order to identify molecular factors associated with parasite differentiation, in this thesis it was studied the association of the T. gondii Hsp90 with the modulation of parasite differentiation and response to stress stimuli using RH ΔUPRT parasites and the cystogenic strain ME49, as well as, a clone derivative of that strain, PK. Our results show that Hsp90 transcript and protein levels increase under stress or bradyzoite differentiation conditions. Moreover, fluorescence microscopy studies revealed that Hsp90 is present in the cytosol of tachyzoites and both in the nucleus and cytosol of mature bradyzoites, suggesting a correlation between its subcellular organization and these two developmental stages. To further characterize the role for Hsp90 in bradyzoite differentiation, T. gondii tachyzoite mutants that are defective in differentiation showed the same staining pattern as tachyzoites under differentiation conditions. In addition, geldanamycin, a benzoquinone ansamycin antibiotic capable of binding and disrupting the function of Hsp90, blocked conversion both from the tachyzoite to bradyzoite and the bradyzoite to tachyzoite stage, suggesting an critical role for this protein in the regulation of stage interconversion. These results thus suggest that Hsp90 may play a role in stage switch. It is known from studies on steroid hormone receptor maturation that Hsp90 does not act alone but in association 4 4 with several different co-chaperones. These co-chaperones bind to Hsp90 and organize it into discrete subcomplexes, each containing a different set of cochaperones. In T. gondii genome we could find several co-chaperones members of the extensively studied Hsp90/Hsp70 based chaperone machinery. Hip and P23 proteins were cloned, sequenced and expressed in order to obtain specific polyclonal antibodies against them. Furthermore, co-immunoprecipitation assays show that Hip and P23 interact with Hsp90 but not between them, suggesting that Hip belongs to early/intermediate Hsp90 complexes (also interacts with Hsp70), and P23 to mature complexes. Both co-chaperones colocalize with Hsp90 at tachyzoite stage. While, at bradyzoite stage only P23 colocalize with Hsp90, Hip is located mainly out of nucleus. Also we cloned and made preliminary characterization of Hop and Hsp40 co-chaperones.
Citación:
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Echeverría, Pablo C.. (2006). Caracterización de la proteína Hsp90 y co-chaperonas de Toxoplasma gondii y su papel en el desarrollo del parásito. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3917_Echeverria
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Echeverría, Pablo C.. "Caracterización de la proteína Hsp90 y co-chaperonas de Toxoplasma gondii y su papel en el desarrollo del parásito". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2006.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3917_Echeverria
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