Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Aspectos inmunológicos y moleculares de la falla ovárica prematura |
| Título alternativo: | Inmunological and molecular aspects of premature ovarian failure |
| Autor: | Sundblad, Victoria |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 2005 |
| Fecha en portada: | 2005 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Charreau, Eduardo H. |
| Director Asistente: | Dain, Liliana B. |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3826_Sundblad |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3826_Sundblad.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3826_Sundblad |
| Ubicación: | Dep.QUI 003826 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Sundblad, Victoria. (2005). Aspectos inmunológicos y moleculares de la falla ovárica prematura. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3826_Sundblad |
Resumen:
La falla ovárica prematura (FOP), caracterizada por amenorrea hipergonadotrófica antes de los 40 años, afecta al 1% de las mujeres en edad fértil. Por su parte, el síndrome de ovario resistente (SOR) es propuesto como una forma folicular de FOP, caracterizado por la presencia de numerosos folículos primordiales en los ovarios. La FOP puede ser de origen autoinmune, iatrogénico, infeccioso, genético/cromosómico o metabólico, entre otros. Cuando no es posible identificar una causa para su desarrollo, la FOP es clasificada como idiopática. Nuestro estudio consistió en abordar el análisis de posibles causas inmunológicas y moleculares de la FOP. En trabajos previos detectamos mediante Western-blot la presencia de anticuerpos dirigidos hacia un antígeno ovárico de ~50 kDa en el 19,1% de un total de 110 pacientes FOP. En esta parte del estudio, trabajamos en la purificación e identificación de esta proteína. Mediante espectrometría de masa identificamos a la enolasa-α como el antígeno específico hacia el cual estarían dirigidos estos anticuerpos anti-ovario en pacientes FOP. Estos resultados fueron confirmados mediante Western-blots en los que se utilizó a la proteína recombinante como antígeno. Concluímos que la determinación de anticuerpos anti-enolasa-α podría significar un aporte importante para el diagnóstico de FOP autoinmune, y su utilización como marcador de autoinmunidad ovárica permitiría brindar a las pacientes un tratamiento acorde a la naturaleza autoinmune del síndrome. Asimismo, realizamos un estudio retrospectivo sobre el análisis de 247 pacientes FOP que habían sido derivadas a nuestro laboratorio para la determinación de la presencia de inmunoglobulinas dirigidas hacia el R-FSH (Ig-R-FSH). Encontramos que sólo las 23 mujeres que habían sido previamente diagnosticadas como SOR presentaban estos anticuerpos. Además, confirmamos que la actividad inhibitoria de las Ig-R-FSH puede ser clasificada en dos grupos: uno con efecto inhibitorio “irreversible”, cuya Ki aparente es 2,94 x 1012 M-1, mil veces mayor que la constante de afinidad de la FSH por su receptor, y el otro con un mecanismo inhibitorio “reversible”, con una Ki aparente similar a la constante de afinidad de la FSH por su receptor. Concluímos que la determinación de estos anticuerpos sería un instrumento importante para el diagnóstico del SOR, permitiendo realizar el diagnóstico principalmente sobre la base de estudios serológicos. Con respecto a las posibles causas genéticas de la FOP, el gen del R-FSH ha sido uno de los genes candidatos más estudiados. Hasta el presente se han descripto 9 mutaciones inactivantes en este gen. En nuestro laboratorio investigamos la presencia de mutaciones en el gen del R-FSH en 20 pacientes FOP, 5 de las cuales habían sido diagnosticadas como SOR, y 44 mujeres controles. Estudiamos la secuencia codificante completa del gen del R-FSH mediante PCR-SSCP, digestión con enzimas de restricción y/o secuenciación directa. No detectamos mutaciones en los exones 1 al 10 en ninguno de los individuos analizados. Además, observamos que los polimorfismos A919G y A2039G del exón 10 se presentan en dos posibles combinaciones, avalando la existencia dos isoformas del R-FSH: Ala307-Ser680 y Thr307-Asn680. Nuestros resultados sugieren que la variante alélica 919G-2039G (OR G vs A= 1,20; IC 95%= 0.53-2.71) o el genotipo homocigota (OR GG vs AG = 1,00; IC 95%= 0.22-4.46; OR GG vs AA = 1,40; IC 95%= 0.25-7.87) no estarían asociados al riesgo de desarrollo de FOP. Además, en dos individuos controles detectamos la presencia de la sustitución C1022T, en heterocigosis. En conclusión, sugerimos que las mutaciones en el gen del R-FSH son poco frecuentes en las pacientes FOP de Argentina. La presencia de una isoforma particular del R-FSH no estaría asociada a la enfermedad. Por su parte, el gen de la inhibina α (INHα) ha sido propuesto como otro gen candidato para el desarrollo de FOP, debido al rol de las inhibinas en la regulación de la FSH. En dos trabajos previos se sugiere que el polimorfismo C129T y la sustitución G769A estarían involucrados en la etiología de la FOP. En este trabajo analizamos 52 pacientes FOP; 14 presentaban FOP asociada a enfermedad/es autoinmune/s (FOP-EA) y las 38 restantes fueron consideradas idiopáticas (FOP-I). Además, estudiamos 136 mujeres controles, separadas en dos grupos: a) menores de 40 años (C<40), y b) mayores de 40 años (C>40). No encontramos diferencias significativas en el riesgo de desarrollo de FOP para el alelo T del polimorfismo C129T, cuando comparamos FOP-I con C<40 o con C>40 (OR T vs C; I-POF vs C<40 = 1.82; IC 95% = 0.88-3.75; OR T vs C; I-POF vs C>40 = 1.07; IC 95% = 0.53-2.16). Obtuvimos resultados similares al comparar los genotipos (OR CC vs (CT+TT) ; I-POF vs C<40 = 2.15; IC 95% = 0.87-5.29; OR CC vs (CT+TT); I-POF vs C>40 = 1.05; IC 95% = 0.43-2.56). La posible implicancia del polimorfismo C129T en los niveles serológicos de inhibinas fue analizada en un grupo de 42 mujeres controles. No hallamos diferencias significativas (p>0,05) entre los grupos CC y CT+TT al comparar los valores de los péptidos de inhibina de la fase folicular media (Pro-αC e Inhibina B), o los valores de la fase lútea media (Pro-αC e Inhibina A). Con respecto a la mutación G769A, hallamos 8/135 controles y 1/52 pacientes FOP (una FOP-EA) heterocigotas para dicha sustitución. La presencia de la variante G769A en un número relevante de individuos controles se describe en este trabajo por primera vez. Nuestros resultados indicarían que las variantes C129T y G769A no estarían asociadas al desarrollo de FOP. En conclusión: i) la proteína enolasa-α sería el el antígeno específico de ~50 kDa hacia el cual estarían dirigidos los anticuerpos anti-ovario en pacientes FOP; ii) las Ig-R-FSH se encontrarían presentes exclusivamente en las pacientes con diagnóstico de SOR; iii) el gen del R-FSH y las variantes C129T y G769A del gen INHα no estarían involucrados en la etiopatología de la FOP en pacientes argentinas.
Abstract:
Premature ovarian failure (POF) is characterized by amenorrhea before the age of 40. POF is usually classified as “follicular” or “afollicular” form. Resistant ovary syndrome (SOR) is proposed as a follicular form of POF, with ovaries in which numerous primordial follicles are present. POF involves almost 1% of the western female population. It is a very heterogeneous syndrome, with a multicausal pathogenesis, and any of the following: chromosomal, enzymatic, iatrogenic, autoimmune or infectious aberration, may be the cause of the disease. In our laboratory, we focused our POF research on some immunological and genetic etiological factors. In previous studies, by Western-blot using ovarian cytosolic fraction antigens, we found that 19.1% of 110 POF patients showed specific reactivity with a ~ 50 kDa antigen. In the present work, we focused on the purification and identification of this protein. NanoLC-ESI-MS/MS identificated α-enolase as the specific antigen to which anti-ovarian antibodies are directed in these POF patients. These results were confirmed by Western-blot using recombinant human α-enolase. In conclusion, detection of anti- α-enolase antibodies by Western-blot could be a suitable marker for diagnosis of autoimmune POF. Its implementation as marker of ovarian autoimmunity may allow treatment of patients according to the immunological nature of their pathology. We also evaluated the presence of circulating immunoglobulins that inhibit FSH binding to its receptor (Ig-FSHR) by FSH-binding inhibition assay, in 247 patients with POF and 60 normally menstruating women (controls). We found that only those 23 patients that had been previously diagnosed as ROS presented Ig-FSHR. The remaining 224 POF patients and 60 control subjects proved negative. In addittion, our results clearly demonstrated that immunoglobulin fractions can be classified into two groups: one, with an “irreversible” nature of inhibitory effect, which Ki was 2.94 x 1012 M-1, a thousand times higher than the affinity constant for FSH-receptor (FSHR) binding interaction, and the other group with a “reversible” mechanism of inhibition, with an apparent Ki similar to the affinity constant for FSHR binding interaction. We concluded that determination of Ig-FSHR could be instrumental in diagnosing ROS, mainly upon the basis of serological findings. Regarding genetic factors, the FSHR gene has long be considered a strong candidate gene for POF. Nine mutations have been described in this gene to date. We investigated the presence of mutations and/or polymorphisms in FSHR gene, in 20 patients with POF, 5 of which were diagnosed as ROS, and 44 controls. The complete coding sequence was analyzed by PCR followed by SSCP, direct sequencing or restriction enzyme analysis. No mutations in FSHR gene were identified in the subjects studied. Polymorphisms A919G and A2039G of exon 10, cosegregated in all the homozygous individuals, indicating that FSHR presents two isoforms: Ala307-Ser680 and Thr307-Asn680. OR results suggested that the 919G-2039G allelic variant (OR G vs A= 1,20; IC 95%= 0.53-2.71) or the homozygous genotype (OR GG vs AG = 1,00; IC 95%= 0.22- 4.46; OR GG vs AA = 1,40; IC 95%= 0.25-7.87) is not associated to disease risk. In addition, a heterozygous substitution C1022T (Val341Ala) was found in two control subjects. We suggest that mutations in FSHR gene are rare in women with POF in Argentine. Presence of a particular FSHR isoform does not appear to be associated with this disease. On the other hand, inhibin-α gene is also proposed as a candidate gene for POF, due to its role in negative feedback control of hypophyseal FSH. In two previous studies, polymorphism C129T and substitution G769A of this gene were suggested to be involved in the etiology of POF. We studied 52 POF patients; 14 presented POF in association with autoimmune/s disease/s (AAD-POF), and the remaining 38 wereconsidered idiopathic (I-POF). As controls, 136 normal women were also studied, divided into two groups: a) controls below the age of 40 years (C<40), and b) controls above the age of 40 years (C>40). We found no significant differences in risk of POF development for the T allele of polymorphism C129T when we compared I-POF either with C<40 or with C>40 (OR T vs C; I-POF vs C<40 = 1.82; IC 95% = 0.88-3.75; OR T vs C; I-POF vs C>40 = 1.07; IC 95% = 0.53-2.16). Similar results were found when genotypes were compared (OR CC vs (CT+TT); I-POF vs C<40 = 2.15; IC 95% = 0.87-5.29; OR CC vs (CT+TT); I-POF vs C>40 = 1.05; IC 95% = 0.43-2.56). The implication of this polymorphism in serum inhibin levels was analyzed in 42 control women, and found no significant differences (p>0.05) between CC and CT+TT groups either when we compared mid-follicular phase inhibin peptide values (Pro-αC and Inhibin B) or when we compared mid-luteal phase values (Pro-αC and Inhibin A). Heterozygocity for the substitution G769A was found in 8/135 controls and only in 1/52 POF women (an AAD-POF). Presence of this substitution in a relevant number of control subjects is herein described for the first time. Our results might indicate that C129T and G769A variants in INH-α gene may not be associated to POF disease. In conclusion: i) α-enolase would be the specific antigen of ~50 kDa to which anti-ovarian antibodies are directed in POF patients; ii) Ig-FSHR would be present only in those patients diagnosed as ROS; c) neither FSHR gene nor C129T and G769A variants in INHα gene would be involved in the etiology of POF.
Citación:
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Sundblad, Victoria. (2005). Aspectos inmunológicos y moleculares de la falla ovárica prematura. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3826_Sundblad
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Sundblad, Victoria. "Aspectos inmunológicos y moleculares de la falla ovárica prematura". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2005.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3826_Sundblad
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