Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos

Pérez, Martín Mariano

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos
Título alternativo:	Cathecholamine-beta-alanyl ligase (CBAL), a key enzyme in the metabolsim of neurotransmitters in insects
Autor:	Pérez, Martín Mariano
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
Publicación en la Web:	2019-03-29
Fecha de defensa:	2004
Fecha en portada:	2004
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Quesada Allué, Luis Alberto
Idioma:	Español
Palabras clave:	CERATITIS CAPITATA; INSECTOS; METAMORFOSIS; ESCLEROTIZACION; AMINAS BIOGENICAS; CATECOLAMINA-BETA-ALANIL LIGASA (CBAL); NBAD-SINTETASA; SISTEMA NERVIOSO; RESPUESTA INMUNE; MUTANTES MELANICOSCERATITIS CAPITATA; INSECTS; METAMORPHOSIS; SCLEROTIZATION; BIOGENIC AMINES; CATECHOLAMINE-BETA-ALANYL-LIGASE (CBAL); NBAD-SYNTHASE; NERVOUS SYSTEM; IMMUNE RESPONSE; MELANIC MUTANTS
Tema:	biología/genética biología/fisiología animal química/química biológica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3736_Perez
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3736_Perez.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3736_Perez
Ubicación:	QUI 003736
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Pérez, Martín Mariano. (2004). Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3736_Perez

Resumen:

En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de lasíntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones delos insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C.capitata. El aporte principal ha sido, justamente, el estudio en detalle de esta enzima. Anteriormente a esta Tesis, ésta era una enzima prácticamente desconocida. Si bien sehabía postulado que el NBAD era el principal precursor de esclerotización de lascutículas marrones de los insectos, excepto nuestro laboratorio, nadie había publicadonada sobre la enzima que lo sintetiza. Se determinó la expresión de la NBAD-sintetasa enla metamorfosis. Se la caracterizó y se demostró que la misma posee una ampliaespecificidad de sustratos. Se demostró por primera vez la actividad de esta enzima ensistema nervioso y respuesta inmune. Se clonó y secuenció por primera vez un mutantemelánico de D. melanogaster, carente de esta actividad enzimática. Por su amplíaespecificidad de sustratos hemos denominado a esta enzima como Catecolamina-B-alanilligasa (CBAL). Los principales resultados obtenidos son: -Se determinó el patrón de expresión de la enzima en el tejido epidérmico duranteel ciclo de vida de C. capítata. La actividad de esta enzima se detectó en momentos muyacotados del ciclo de vida, coincidiendo con los momentos en que los individuos necesitanesclerotizar sus cutículas. Esta actividad es dependiente de la hormona de la muda 20-OH-ecdisona. La actividad está ausente en el tegumento de las larvas, pues las mismas son decutícula blanda y no sufren el proceso de esclerotización. El primer momento durante elciclo de vida en que se detectó la actividad fue en las prepupas cuando se forma el pupario. Luego de varias horas la actividad fue indetectable hasta el estadío de adulto farado dondese volvió a registrar la actividad extendiéndose ésta hasta la emergencia del adulto. -Se descubrió y se dosó por primera vez in vitro la actividad NBAD-sintetasa entejido nervioso. Se estudió el patrón de expresión y se determinó que la actividad en estetejido es constante a lo largo del ciclo de vida. Incluso se detectó actividad en el “cerebro”de las larvas, hecho significativo puesto que en este estadío nunca se detectó esta actividaden la epidermis. En adultos se demostró que la actividad en el sistema nervioso permanece constante durante todo el estadío, mientras que en la epidermis, luego de las primeras 48horas, cuando ya ha finalizado el proceso de la esclerotización, no se detecta más laactividad. - Por primera vez se observó que la NBAD-sintetasa participa en la respuestainmune innata de los insectos. Esta actividad se manifiesta solamente cuando losindividuos son invadidos por un patógeno o cuando se produce una injuria en la cutícula. También se determinó la función antibacteriana del NBAD. - Se caracterizaron las diferentes actividades enzimáticas y se concluyó que todascorresponderían a una misma enzima. La misma mostró una amplia especificidad desustrato, siendo capaz de conjugar β-alanina con catecolaminas, indolaminas eimidoaminas. Por primera vez se logró sintetizar in vitro: NBANE, NBAOA; NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinina) y NBATyr (sarcofagina). Debido a la amplia especificidadde sustrato que mostró, hemos denominado a esta enzima como “Catecolamina-β-alanilligasa” (CBAL). - Se estudiaron los mutantes melánicos niger de C. capitata y ebony de D.melanogaster. Se determinó que ambos mutantes son homólogos; los dos carecen de laactividad NBAD-sintetasa en epidermis (esclerotización y respuesta inmune) y en sistemanervioso. Ambos mutantes muestran deficiencias en el comportamiento. El estudio de losmutantes demostró que las proteínas responsables de las actividades enzimáticascorresponden a un único gen. - Se clonó y secuenció el gen ebony de D. melanogaster en la cepa salvaje y elmutante e4. Se demostró, mediante Northern blots, que el ARNm del mutante es de menortamaño que el de la cepa salvaje. Luego se secuenció y se comprobó que el gen delmutante posee una deleción de 447 pb en el primer exón. Además se observó que en elsitio de la deleción se insertaron 15 nucleótidos pertenecientes a una secuencia extraña, lacual fue analizada y arrojó homología con una secuencia perteneciente a un gen debaculovirus. Se analizó, además, la región promotora y se encontraron secuencias dereconocimiento para genes que responden a 20-OH-ecdisona, factores de transcripción queactúan en tejido epidérmico, tejido nervioso o en la respuesta inmune. - Se comenzó a estudiar preliminarmente la enzima NBAD-hidrolasa. La mismamostró un patrón de expresión diferente a la sintetasa. La expresión de esta enzima se registró durante todo el ciclo de vida. También se observó que se expresa en tejidonervioso. Esta enzima también mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capazde hidrolizar los diferentes productos que sintetiza la NBAD-sintetasa. Los resultados obtenidos han permitido poner en evidencia la actividad de laenzima CBAL durante el ciclo de vida de C. capitata y los procesos fisiológicos en los queinterviene, claves en la evolución de los insectos. También se abrió un nuevo panorama enel estudio del metabolismo de aminas biogénicas y se aportó información para conocer elmetabolismo de β-alanina en insectos.

Abstract:

In the present Thesis it has been studied the enzyme NBAD-synthase, responsiblefor the syntesis of NBAD the main precursor for tanning and sclerotization the insect browncuticles. This enzyme has been characterized and was studied its expression profile in the C. capitata life cycle. The principal contribution has been the detailed study of this enzyme. Before this Thesis, it was an almost unknown enzyme. It has been postulated that the NBAD is the main precursor for the sclerotization of insect brown cuticles, but except ourlaboratory, nobody has published anything about the synthesizing enzyme. It has beendetermined the expression profile of the enzyme during C. capitata metamorphosis. It hasbeen observed that this enzyme showed a wide substrate specificity. For the fisrt time it hasbeen demonstrated the activity of this enzyme in nervous tissue and in innate immuneresponse. It has been cloned and sequenced for the first time a Drosophila melanogastermelanic mutant, lacking the NBAD-synthase activity. Due to its wide substrate specificitywe proposed identify it as Catecholamine B-alanyl-ligase (CBAL). The main obtained result are: - It has been determined the expression profile of the enzyme in the epidermal tissueduring the life cycle of C. capitata. The activity of this enzyme has been detected in narrowdevelopmental windows in differents stages during the life cycle. All those developmentalwindows where the enzyme was expressed were in coincidence with the momment whenthe fly must sclerotize its cuticle. This activity is absent in the larval integument, this isbecause they are maggots with soft cuticle and it never suffer the sclerotization process. The first time when this activity has been observed was in the prepupa, during pupariumformation. After several hours the activity disappeared until the pharate adult stage when itwas evident again and remained until the imago emergence. - It has been discovered and determined for the first time the activity of this enzymein the nervous system of insects and we showed that this activity is expressed constitutivelyduring the whole life cycle. Indeed the activity was measured in the larval brain, this isstriking because the activity is absent from the epidermal tissue. It has been shown that inthe adult stage while the epidermal activity drops to undetectable levels, after the first 48hours, when the sclerotization process had finished, in nervous tissue it kept on constant. - It was observed for the first time that NBAD-synthase is activated during theimmune response in insects. The NBAD-synthase is activated only when the insect isinfected by a microorganism. It has been also demonstrated the antibacterial activity of NBAD. - It has been characterized the different enzymatic activities and it was observed thatall of them belong to the same enzyme. This enzyme showed a wide substrate specificity,being capable of synthesize different β-alanyl derivatives of catecholamines, phenolamines,indolamines and imidoamines. It has been synthesized, for the first time in vitro: NBANE, NBAOA, NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinine) and NBATyr (sarcophagine). Due to itsbroad substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine β-alanyl ligase (CBAL). - It has been studied the melanic mutants niger of C. capitata and ebony of D.melanogaster. It has been shown that both mutant are homologous, this two mutants lackthe NBAD-synthase activity in the integument (sclerotization and immune response) and inthe nervous tissue. These both mutants also have behavioural anomalies. The studiescarried out on these mutants demonstrated that the responsible enzymatic activities arecodified by an unique gene. - It has been cloning and sequenced the ebony gene from D. melanogaster wild typeand ebony4 (e4) strains. By Northern blot assays has been observed that the mutant mRNAis smaller than the wild type one. Thereafter by sequencing it has been demonstrated thatthe mutant gene has a 447 bp deletion in its first exon. Moreover it has been observed in thedeletion site 15 exogenous nucleotides inserted, and it sequence showed great similaritywith a baculovirus gene. It has been studied the expression pattern in the D. melanogasterlife cycle. Using a computational program it has been analized the promoter region of thisgene and it has been observed the presence of sequences for different transcription factorrecognition sites, such as those that respond to 20-OH ecdysone, transcription factor thatare expressed in epidermal or nervous tissue and those that modulate the immune response. - Preliminary it has begun to be studied the enzyme NBAD-hydrolase. This enzymeshowed an expression pattern different for that of NBAD-synthase. The expression of theformer has been detected during the whole life cycle of C. capitata. As it occurs with the NBAD-synthase, the NBAD-hydrolase is also expressed in nervous system and is capableto hydrolisate the alternative products synthesized by the NBAD-synthase. All these results has allowed to show the activity of CBAL during the whole lifecycle of C. capitata and the physiological process where it participates, very importantduring the evolution of insects. A new subjet in the study of metabolism of biogenic amineshas been opened and it has been given a new information on the metabolism of β-alanine ininsects.

Citación:

---------- APA ----------

Pérez, Martín Mariano. (2004). Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3736_Perez

---------- CHICAGO ----------

Pérez, Martín Mariano. "Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2004.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3736_Perez

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