Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | biologia |
Título: | Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos |
Autor: | Distéfano, Ana Julia |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Lugar de trabajo: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA)
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 2003 |
Fecha en portada: | 2003 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
Departamento Docente: | Departamento de Biología |
Director: | Vas, Mariana del |
Idioma: | Español |
Palabras clave: | MAL DE RIO CUARTO; MRCV; FIJIVIRUS; REOVIRIDAE; DSRNA; RNA POLIMERASA DEPENDIENTE DE RNA; PROTEINA MAYORITARIA DE CAPSIDE INTERNA; PROTEINA DE CAPSIDE EXTERNAMAL DE RIO CUARTO DISEASE; MAL DE RIO CUARTO VIRUS; MRCV; FIJIVIRUS; REOVIRIDAE; DSRNA; RNA DEPENDENT RNA POLYMERASE; MAJOR CORE CAPSID PROTEIN; OUTER SHELL CAPSID PROTEIN |
Tema: | biología/biología molecular y celular biología/virología
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Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3687_Distefano |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3687_Distefano.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3687_Distefano |
Ubicación: | BIO 003687 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Distéfano, Ana Julia. (2003). Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3687_Distefano |
Resumen:
El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado porel Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, ytiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Lasparticulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa deproteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, sehan reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus),el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentosgenómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y característicasdel serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentranrepeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos lossegmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formarestructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales dereplicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidosdeducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y seidentificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Sedeterminó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contienemotivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a lascodificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadaspor el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de quela proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para unaproteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápsideinterna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientescodificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología conmiembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función sedesconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por lossegmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDacuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con lasproteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codificapara una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que escaracterístico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadaspor el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable funciónde helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable funciónsería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con lasproteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintossegmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evoluciónindependiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitióproponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debeser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no unaraza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisisfilogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas detodos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivosseparados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otroagrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndoseproteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fuecapaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes enpartículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteinacorrespondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En unexperimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partículaviral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismoel antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteínade tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos deinmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV seconfirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural delvirus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconocióespecíficamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totalesde plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobrecortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificadapor el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa quecorrespondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNAcodificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentesinteraccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virusque causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo yal estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de unaestrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en eldesencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).
Abstract:
Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodeskuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interestingfeature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and inmany cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirusgenome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fijidisease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Riceblack streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequencesof MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have theconserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In additionsegment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identifiedimmediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure ofall segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined andstable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic proteinthat contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to othergenera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which hasand intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In thiswork we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein andhas an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity tomembers of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function isunknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein containsan ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows ahigh identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. Thecomparative level of homology between different MRCV encoded proteins variednoticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based onphylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV,it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidicsequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed theexistence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: onegrouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second onegrouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with anhistidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able tospecifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This proteincorresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against thepurified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed inbacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specificallydetect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infectedmaize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the proteincoded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maizeplants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itselfwith a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNAdependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondentproteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within thegenera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirusgenus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maizeplants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS).
Citación:
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Distéfano, Ana Julia. (2003). Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3687_Distefano
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Distéfano, Ana Julia. "Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3687_Distefano
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