Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba |
| Autor: | Goutman, Juan D. |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2003 |
| Fecha en portada: | 2003-12 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Calvo, Daniel J. |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
biología/neurociencias
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3635_Goutman |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3635_Goutman.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3635_Goutman |
| Ubicación: | Dep.BIO 003635 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Goutman, Juan D.. (2003). Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3635_Goutman |
Resumen:
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central devertebrados y hasta el momento se han caracterizado tres tipos de receptores de GABA, según sus propiedadesfarmacológicas: GABAa, GABAb y GABAc. Los receptores de GABAa (GABAaR) y GABAc (GABAcR) compartenademás su mecanismo de señalización, ambos son receptores ionotrópicos con una alta permeabilidad a iones cloruro. Los receptores de GABAb son metabotrópicos, generalmente acopladas a proteínas G. En esta tesis se presenta una extensa caracterización de las propiedades farmacológicas y biofísicas de los receptoresde GABA, con especial énfasis en los GABAcR Este subtipo de receptores de GABA fue el último en ser identificadoy se caracteriza por su insensibilidad al antagonista clásico GABAérgico, bicuculina y por el lento curso temporal desus respuestas. Este trabajo se realizó expresando los receptores en ovocitos de Xenopus laevis y estudiando suspropiedades con dos diferentes técnicas electrofisiológicas: fijación de voltaje con dos electrodos (FVDE) y patchclampen la configuración outside out. Los receptores ionotrópicos de GABA (GABA-R) son modulables por una diversidad de compuestos de diferentenaturaleza química. Entre ellos se encuentran los flavonoides (F), una familia de compuestos aislados de plantasvasculares que presentan una gran variedad de acciones neurofarmacológicas. Algunos son ansiolíticos y sedantes, y seha propuesto que su mecanismo de acción sería a través de los GABAaR. En este trabajo, evaluamos la acción de ungrupo de F sobre las respuestas mediadas por GABA-R. Los F utilizados en este trabajo fueron: quercetina, crísina,apígenina, morina, flavona y α-naftoflavona. Contra lo esperado, los F evaludados tuvieron un efecto inhibitoriogeneral tanto sobre los GABAaR como los GABAcR. Quercetina fue el más potente para ambos receptores con un IC50de aproximadamente 4 µM en cada caso. También se evaluó la acción de quercetina en otros receptores ionotrópicos deneurotransmisores, como los colinérgicos nicotínicos, serotonina y kainato. En todos ellos se observaron efectosinhibitorios con distinta potencia. Tanto los GABAaR como los GABAcR son sensibles al alcaloide picrotoxina. Se han propuesto distintosmecanismos para su acción sobre los GABAaR incluyendo efectos no-competitivos y mixtos. Sin embargo, aún no seha esclarecido suficientemente el mecanismo de acción en los GABAcR. Picrotoxina produjo una inhibición reversiblecon un IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. La curva dosis-respuesta (D-R) para GABA en presencia del antagonista (1, 10 y 100 µM)sufrió un desplazamiento hacia la derecha y para las concentraciones más altas de esta toxina, una reducción en larespuesta máxima. Este resultado sugeriría un mecanismo de acción de tipo no-competitivo. No obstante, al igual quelos antagonistas competitivos, las respuestas a concentraciones bajas de GABA fueron más sensibles a picrotoxina quelas más altas. La inhibición por esta toxina fue también dependiente del uso, es decir, requirió la activación de losreceptores para ejercer su efecto. La recuperación de la inhibición también fue facilitada por la acción de GABA. Además, picrotoxina produjo un aumento en la velocidad de de-activación de las respuestas al GABA, sugiriendo unmecanismo de tipo no-competitivo. En resumen, la inhibición de los GABAcR por picrotoxina tendría un mecanismode acción no-competitivo o mixto, y dependiente del uso aunque menos que los GABAaR. Los GABAcR son sensibles a la modulación por iones trivalentes de la serie de los lantánidos (L) que producen unincremento en las respuestas a GABA. En un estudio previo se caracterizó la acción de uno de los elementospertenecientes a los L, lantano (La³+); mientras que en este trabajo se analizaron los efectos de otro, lutecio (Lu³+). Yaen experimentos preliminares, se observó que la acción de Lu³+ sería más compleja ya que produjo un aumento rápidode la corriente, seguido de una atenuación durante la aplicación del ión sobre la respuesta a GABA. Lu³+ provocó unaaumento en la afinidad aparente por GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) y un incremento en la respuesta máxima a concentracionessaturantes de agonista. También se evaluó cómo afectaba la presencia de Lu³+ a la acción de ciertos antagonistas, comoparámetro de la función de los GABAcR. El antagonista competitivo, TPMPA, inhibió las respuestas evocadas por GABA en presencia de Lu³+ con una potencia semejante a lo observado en ausencia de este ión. No obstante, no tuvoun efecto protector de la atenuación de la respuesta mediada por Lu³+, sugiriendo que este proceso sería operado poreste ión independientemente de GABA. Las respuestas evocadas en presencia de Lu³+ también fueron sensibles apicrotoxina pero con caracteristicas diferentes a lo ya descripto. Se elaboró, además, un modelo de gating de los GABAcR y de la acción de Lu³+, donde se propone la existencia de dos estados abiertos, revelado por la presencia deeste ión, que además mediaría un proceso de desensibilización independiente de GABA. Los estudios existentes sobre la cinética de los GABAcR fueron hechos con técnicas de pobre resolución temporal, ypor esto decidimos realizar esta serie de experimentos en parches de membrana con la técnica de patch-clamp en laconfiguración outside out. Las respuestas al GABA obtenidas con esta metodología presentaron un curso temporalcaracterístico de los GABAcR: activación y de-activación lentas, de varios segundos de duración, con escasadesensibilización. La afinidad aparente por GABA calculada fue 4.0 ǂ 0.8 µM con un n de Hill = l.7 ǂ 0.5. La relacióncorriente-voltaje fue lineal, y el canal mostró una permeabilidad alta a cloruro. Se evaluó la sensiblidad de los GABAcR en parches de membrana a una serie de agonistas (TACA, β-alanina, glicina), antagonistas (TPMPA,picrotoxina, quercetina, zinc) y moduladores (La³+ y Lu³+) conocidos. Todos estos produjeron efectos similares aldescripto previamente. Un estudio más profundo de la cinética de de-activación de las respuestas mostró que aconcentraciones altas de agonista, la relajación era mejor descripta por ecuación de decaimiento exponencial desegundo orden; mientras a dosis cercanas al EC50,de primer orden. Esto sugeriría un modelo de gating con dos estadosabiertos con distinta cantidad de moléculas de agonista unido, que fue evaluado realizando simulaciones numéricas dela actividad del receptor.
Abstract:
γ-arninobutyric acid (GABA) is the main inhibitory neurotransmitter in vertebrate central nervous system. Three GABA receptors subtypes have been described according to their pharmacological properties: GABAa, GABAb, and GABAc. GABAa (GABAaR) and GABAc (GABAcR) receptors also share their signaling mechanism, they are bothionotropic receptors with high chloride permeability. GABAb receptors are metabotropic and commonly coupled to G protein. In this thesis, we show an extent pharmacological and biophysical description of GABA receptors with specialinterest in GABAcR. This is the more recently identified GABA receptor and characterizes by its resistance to theclassic GABAergic antagonist, bicuculine, and its slow time-course responses. Receptors were studied in this workby means of the expression in Xenopus laevis oocytes and two different electrophysiological techniques: two electrodevoltage clamp (TEVC) and patch-clamp in outside out configuration. Ionotropic GABA receptors (GABA-R) can be modulated by a variety of compounds with different chemicalstructure. Flavonoids (F) are a group of compounds isolated from vascular plant that show distinctneuropharmacological effects. Some of them are anxiolytic and sedative, and a mechanism mediated by GABAreceptors has been suggested. In this study, we have evaluated the effects of a group of F on GABA receptorsfunction. The F tested were: quercetin, chrisin, apigenin, morin, flavone and α-naphtoflavone. Unexpectedly, these Fshowed an overall inhibitory effects on GABAaR and GABAcR. Quercetin was the most potent antagonist on bothtypes of receptors with an IC50 value of approximately 4 µM. The actions of quercetin on other ionotropicneurotransmitter receptors, like cholinergic nicotinic, serotonin and kainate, were also tested. Different degrees ofinhibition were observed in all of them. Both GABAaR and GABAcR can be blocked by the alkaloid picrotoxin. Different mechanisms of action havebeen proposed for the inhibition of this antagonist on GABAaR, including non-competitive and mix effects. However, the exact mechanism of action for GABAcR has not been clarified yet. Picrotoxin produced a reversibleinhibition on GABAcR with an IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. Dose-responses (D-R) curves in the presence of this antagonist (1, 10 and 100 µM) were right-shifted and an insumountable blockage was seen for high concentrations of toxin. Allthese suggest a non-competitive mechanism of action. However, as described for competitive antagonists, inhibitionwas more profound with low agonist concentrations than higher. Picrotoxin action was also use-dependent, i.e.,receptor activation was required to exert its effect. Antagonist wash out was also facilitated by GABA action. Inaddition, picrotoxin produced an increase in de-activation rate of GABA-evoked responses, suggesting a non competitiveeffect. In summary, GABAcR inhibition by picrotoxin would present a non-competitive or mixmechanism of action, and also use-dependent effect, but in a lower degree than GABAaR. GABAcR can be modulated by trivalent cations from lanthanides (L) series that produce an increase in GABA evokedresponses. The actions of lanthanum (La³+), one of the L, on GABAcR have been characterized in a previousstudy, and here we have analyzed the effects of other L, lutetium (Lu³+). In preliminary experiments, Lu³+ showedmore complex actions, with a fast increase in GABA-evoked current, followed by attenuation during ion application. An increase in apparent affinity for GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) and also in maximal efficacy was observed in thepresence of Lu³+. The inhibition of some antagonists was evaluated in the presence of Lu³+ as a parameter for GABAcR function. TPMPA, a competitive antagonist, inhibited the action of GABA and Lu³+ with a potency similarto that was observed in the absence of this ion. However, Lu³+ mediated current attenuation was not protected by thisantagonist, suggesting that this process would be operated by this modulator independently of GABA. GABA-evokedresponses in the presence of Lu³+ could also be inhibited by picrotoxin but with a different profile than waspreviously described. In addition, a model for GABAcR gating and Lu³+ actions has been elaborated, in which twoopen states were proposed based on this ion effect, that would also mediate a desensitization process independent of GABA. Currently available studies on GABAcR kinetics have been carried out with techniques devoid of a proper timeresolution. This is why we decided to perform experiments on membrane patches with the patch-clamp technique inoutside out configuration. GABA-evoked responses showed typical GABAcR characteristics when obtained with thismethodology: slow activation and de-activation kinetics, and poor desensitization even at high agonistconcentrations. An apparent affinity for GABA of 4.0 ǂ 0.8 µM was calculated with a Hill coefficient = 1.7 ǂ 0.5. Current-voltage relation was lineal, and the channel was highly permeable to chloride. GABAcR present inmembranes patches were tested with distinct already-known agonists (TACA, β-alanine, glycine), antagonists (TPMPA, picrotoxin, quercetin, zinc) and modulators (La³+ and Lu³+). They all showed similar effects to what wasalready described. An extensive study on de-activation kinetics of GABA-evoked currents showed that relaxation athigh concentrations was better fit by a second order exponential decay equation, while at EC50 doses a first order wasused. This would suggest a gating model with two open states with distinct number of agonist bound molecules, thatwas evaluated by numerical simulations of receptors function.
Citación:
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Goutman, Juan D.. (2003). Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3635_Goutman
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Goutman, Juan D.. "Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3635_Goutman
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