Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico |
| Autor: | Goldberg Cavalleri, Alina Viviana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agrícola (INTA) Castelar. Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2003 |
| Fecha en portada: | 2003 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Romanowski, Víctor |
| Director Asistente: | Sciocco de Cap, Alicia |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
biología/control biológico
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3582_GoldbergCavalleri |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3582_GoldbergCavalleri.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3582_GoldbergCavalleri |
| Ubicación: | Dep.BIO 003582 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Goldberg Cavalleri, Alina Viviana. (2003). Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3582_GoldbergCavalleri |
Resumen:
El “barrenador de los brotes", Epinotia aporema, es una de las principales plagas deleguminosas en América del Sur. Las larvas de esta plaga, son infectadas por ungranulovirus (EpapGV) el cual representa una de las principales causas de epizootiasesporádicas en poblaciones de E. aporema. En el trabajo de tesis, se realizaron estudiosbiológicos y patológicos sobre EpapGV en larvas del insecto huésped, los cualesestablecieron una base de conocimientos importante para determinar distintos aspectosde la interacción virus-huésped. Ensayos en laboratorio demostraron que el virus esaltamente virulento y especie específico, lo que indica que es un buen candidato para serutilizado en el control biológico de la plaga. Larvas infectadas con EpapGV sufrieron unretraso en el desarrollo, siendo inhibido el proceso de muda. Además, exhibieron unincremento en el peso mayor al observado en larvas sin infectar. Esto pudo deberse a laexpresión del gen viral egt cuyo producto altera la fisiología de los insectos. Medianteexámenes de tejidos al microscopio óptico y electrónico, por medio de las técnicas deinmunohistoquimica e hibridación in situ (ARN-ARN), se observó que EpapGV causainfecciones de tipo poliorganotrópicas. Los principales tejidos afectados fueron eladiposo, la epidermis y la matriz traqueal. Luego de infectar el intestino medio, ladiseminación del virus hacia otros tejidos se produce aparentemente vía hemolinfa. Losviriones producidos en células infectadas se acumulan entre la membrana plasmática y lalámina basal, lo que indica que dicha lámina constituye una barrera efectiva paradiseminación de la infección. Mediante la técnica de inmuno-oro se detectó expresión degranulina dentro del núcleo, lo cual indica que la expresión de genes tardíos ocurre luegode la ruptura de la membrana nuclear. Análisis computacional de las secuencias de losextremos de clones de la biblioteca genómica de EpapGV generada en el laboratorio,permitieron identificar una posible proteína de fusión (Epap-F). El gen completo fuesubclonado, secuenciado y analizado mostrando motivos característicos de las proteinas F de Nucleopolyhedrovirus (involucradas en la entrada del virus a una nueva célula). Sinembargo, no se había demostrado la funcionalidad de proteínas F de Granulovirus. Mediante la técnica de Northern blot se confirmó la expresión de dicho gen y se estudió suexpresión temporal. Posteriormente, a través de la técnica de RACE, se mapeó elextremo 5' no codificante demostrándose que la transcripción del gen se realiza a partirde un motivo típico de transcripción tardío (CAGT) y también a partir de un motivo noconvencional ATGC. Para demostrar la actividad fusogénica de dicha proteína se realizóun ensayo de actividad transiente in vitro. Para ello, se transfectó un cultivo de células (Spodoptera frugiperda. Sf21) con un plásmido conteniendo el ORF completo de Epap-Fbajo el promotor ie-1 de Anticarsia gemmatalis MNPV, se modificó el pH del medio a 5 yse registró formación de sincicios. Con el fin de producir anticuerpos que reconozcan a Epap-F, se expresó dicha proteína utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Losanticuerpos serán utilizados para la determinación de la ubicación subcelular de dichaproteína.
Abstract:
The bean shoot borer, Epinotia aporema, is a major pest of legume crops in South America. Larvae of this pest are infected by a granulovirus (EpapGV) that is the mostimportant cause of sporadic epizooties in E. aporema populations. This PhD dissertationdeals with the biological and pathogenesis studies on EpapGV on the host larvae thatprovide the basic information of the virus-host interaction. The high specificity andpathogenicity indicate that EpapGV is a good candidate for the biological control of thispest. Larvae infected by EpapGV, suffered a retardation of development and typicallyfailed to pupate, but exhibited a weight increase greater than that of healthy larvae. It ispossible that the effect observed was due to the expression of the egt viral gene whoseproduct alters the insect physiology. Using immunohistochemistry and in situ hybridization (by both, light and electron microscope) we observed that EpapGV caused apolyorganotropic infection. We found that the fat body, epidermis and tracheal matrix werethe main tissues infected. Virions liberated from the midgut may gain entry to other tissuesvia circulation through hemolymph. Virions produced by infected cells accumulatedbetween the plasma membrane and basal lamina, this indicated that the basal lamina is aneffective barrier for the spread of the infection. Granulin was detected in the nucleus byimmuno-gold staining. indicating that late gene expression occurred prior to nuclearmembrane disruption. Computer-assisted analysis of the sequence of the end sequences EpapGV clone library produced in our lab, revealed a putative fusion protein (Epap F). The complete gene was subcloned, sequenced and analyzed revealing aminoacids motifof characteristic for Nucleopolyhedrovirus F proteins (involved in virus entry to a new cell). However no functional F protein had been demostrated in any Granulovirus. Northernblots were used to confirm the transcription of this gene and to study its temporalexpression. Employing the RACE technique we mapped the 5' untranslated region and wefound that the transcription starts at a typical late gene (CAGT) motif and also at anunconventional (ATGC) motif. In order to demonstrate the fusion activity of Epap-F, wecarried out a transient expression assay. To this end, a Spodoptera frugiperda (Sf 21) cellline was transfected with an expression plasmid containing the Epap-F ORF under thecontrol of the Anticarsia gemmatalis MNPV ie-1 promoter and, alter lowering the pH to 5many extensive syncytia were observed. With the aim of producing antibodies against Epap-F, the protein was expressed using a baculovirus expression system. The antibodieswill be used to determine the subcelular localization of this protein.
Citación:
---------- APA ----------
Goldberg Cavalleri, Alina Viviana. (2003). Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3582_GoldbergCavalleri
---------- CHICAGO ----------
Goldberg Cavalleri, Alina Viviana. "Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3582_GoldbergCavalleri
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