Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores

Otero, Marcelo Javier

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores
Título alternativo:	Construction and characterization of complex biomolecules structures with application in biosensors design
Autor:	Otero, Marcelo Javier
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2003
Fecha en portada:	2003
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Director:	Calvo, Ernesto Julio
Idioma:	Español
Palabras clave:	PELICULAS AUTOENSAMBLADAS; ELECTRODOS ENZIMATICOS E INMUNOLOGICOS; MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO; PROPIEDADES VISCOELASTICAS; AVIDINA-BIOTINA; ANTIGENO-ANTICUERPOSELF-ASSEMBLED MULTILAYERS; ENZYMATIC AND IMMUNOLOGICAL ELECTRODES; QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE; VISCOELASTIC PROPIERTIES; AVIDIN-BIOTIN; ANTIGEN-ANTIBODY
Tema:	química/electroquímica química/química analítica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3562_Otero
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3562_Otero.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3562_Otero
Ubicación:	Dep.QUI 003562
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Otero, Marcelo Javier. (2003). Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3562_Otero

Resumen:

Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento moleculardonde una biomolécula interactúa en forma altamente específica con unanalito y donde el cambio químico producido en presencia del analito setraduce en una señal eléctrica procesable. Una de las etapas másimportantes en el diseño de un biosensor es la de generar unaestructura o superestructura, en la cual estén insertas las biomoléculasresponsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependerán laactividad de la biomolécula, la sensibilidad, la especificidad y el ámbitode uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de lainmovilización de enzimas y anticuerpos en el contexto de laconstrucción de electrodos enzimáticos para la detección de glucosa yde la construcción de sensores inmunológicos para detectar moléculaspequeñas a través de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron enforma complementaria distintas técnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometría, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)y diversas Técnicas Electroquímicas. Como técnicas de inmovilización se utilizaron la funcionalizacióncovalente de superficies, el autoensamblado electrostático, el empleo deuniones de importancia biológica como avidina-biotina o antígeno-anticuerpoen la inmovilización de enzimas y el uso de proteínasorientadoras como proteína A y proteína G para la inmovilización deanticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristalde cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas deglucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente conun complejo de Os: [Os(bpy)2ClPyCOH]+, (PAH-Os), depositadas sobresuperficies de oro modificadas con ácido 3-mercaptopropansulfónico (MPS). Las etapas de adsorción del polímero y la glucosa oxidasa serepitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificadoshasta con 14 bicapas de polímero-enzima. El espesor elipsométrico,determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las películasautoensambladas, determinadas por QCM en condicionesgravimétricas, se determinaron en contacto con solución de electrolito yen condiciones de sequedad y se estimó a partir de dichas mediciones ladensidad de la película en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extracciónde las propiedades viscoelásticas de peliculas autoensambladas porcombinación de QCM y elipsometría. Por combinación del espesor ydensidad estimados de la película, la expresión de la impedanciamecánica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad delelectrolito, se pudieron estimar los valores de los módulos dealmacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una películaautoensamblada como función del espesor y el potencial de electrododurante dos tipos de perturbaciones electroquímicas: voltametría cíclicay saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas técnicas, QCM yelipsometría en el estudio de la construcción de películasautoensambladas, éstas se emplearon para el estudio del crecimiento depelículas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Osutilizando dos estrategias distintas de inmovilización de la enzima: laformación de una unión antígeno-anticuerpo y la formación de unaunión avidina-biotina. Se estudió la cinética de adsorción de lasbiomoléculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durantela inmovilización de la enzima. Se estudió además el comportamientobiocatalítico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en lasdistintas estructuras autoensambladas y se llegó a la conclusión de quela eficiencia de la comunicación eléctrica entre las enzimas y elmediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilización de la enzima,como por la cantidad de centros redox del polímero de osmio por cadamolécula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructurasautoensambladas no solamente tienen aplicación en el diseño deelectrodos enzimáticos, sino también en el desarrollo de biosensoresinmunológicos. La formación de una unión antígeno-anticuerpo nogenera una señal medible por lo cual se recurre al uso de sustanciasmarcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrolladosúltimamente están basados en el uso de enzimas oxidoreductasas comomarcadoras. Además de los marcadores es necesario utilizarmediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitioredox de la enzima y revelar la actividad enzimática a través de la señaldel mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tantoel transductor para la detección enzimática, como el soporte inertesobre el cual se inmovilizan los antígenos o los anticuerpos. En estecontexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y unanticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensormodelo para la detección de moléculas pequeñas (como la biotina) através de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimáticobasado en peroxidasa de rábano, HRP-biotina. Con la técnica de EQCMse estudió la deposición de las multicapas, es decir la cantidad de IgGdepositada en cada capa, los cambios viscoelásticos durante laadsorción, la cinética de adsorción para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la técnicade AFM se observó la estructura y orientación de las moléculas de IgGadsorbidas sobre el polímero y finalmente con las técnicaselectroquímicas se estudió el crecimiento de las bicapas y la utilidad dela supraestructura como biosensor, a través del estudio de la catálisisenzimática del conjugado. Finalmente se describen resultadospreliminares sobre el uso de proteínas orientadoras, proteína A y G’,utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer lareacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusión, los resultados obtenidos confirman que lainmovilización de biomoléculas es por cierto una de las etapas másimportantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta delmismo. Además se muestra la necesidad de recurrir a distintas técnicaspara su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias decada técnica.

Abstract:

A biosensor is a molecular recognition device, in which abiomolecule interacts high specifically with an analyte and where thechemical change produced by its presence is transduced into aprocessable electric signal. One of the most important stages ofbiosensor design is the generation of a structure or superstructure thatcontains the biomolecules responsible of the sensor response. Thebiomolecule activity, the sensibility, the specificity and the use of thebiosensor depend on this stage.ln this thesis were studied different aspects of the enzymes andantibodies immobilization in the context of the development ofenzymatic electrodes for glucose detection and the construction ofimmunosensors for the detection of small molecules through acompetitive assay. For this purpose several complementary techniqueswere used such as Quartz Crystal Microbalance (QCM), Ellipsometry, Atomic Force Microscopy (AFM) and electrochemical techniques. Different types of immobilization were used namely electrostaticself-assembly, covalent functionalization of surfaces, the use ofbiological unions like avidin-biotin or antigen-antibody for theimmobilization of enzymes and the use of binding proteins like protein Aand protein G for the immobilization of antibodies. First of all have been described the used of the Quartz Crystal Microbalance for the study of layer by layer self assembled multilayersof glucose oxidase (GOx) and a redox polymer polyallylamine-Os(bpy)2ClPyCH2NH (PAH-Os), deposited on to thiol modified goldsurfaces. The alternate adsorption steps of the polymer and the enzymewere repeated, reaching up to 14 polymer-enzyme bilayers. Theellipsometric thickness and the QCM gravimetric response weredetermined for the self-assembly films under electrolyte solution and inair. The density of the films was estimated in both environmentalconditions. In this thesis a general strategy for the determination of theviscoelastic properties of self-assembled multilayers with thecombination of QCM and ellipsometry has been suggested. Bycombininig the estimated film thickness and density, the expression ofthe electrical impedance of the modified quartz crystal surface and theproperties of the solution, it was possible to estimate the storage (G’)and loss gear (G”) moduli at 10 MHz for a self-assembled film as afunction of the thickness and electrode potential under two differentelectrochemical perturbations: Cyclic Voltammetry and Potential Steps. Once the combination of both techniques proved to be useful inthe study of film construction, they were used to study the growth ofself-assembled monolayers of biotinylated glucose oxidase and PAH-Osby using two different approaches of enzyme immobilization: theantigen-antibody binding and the avidin-biotin binding. The adsorptionkinetics, the specificity of the interactions, and the biocatalyticalbehaviour of the immobilized enzyme in the different strategies werestudied. It was concluded that not only is the electrical wiring efficiencybetween the enzyme and the mediator affected by the immobilizationstrategy, but also by the relationship between the concentration ofredox centers and the concentration of enzyme. It is currently widely known that the immobilized redox enzymesin self-assembled structures can be applied in the design of enzymaticelectrodes, but also in the development of immunological biosensors. The binding between an antigen and the specific antibody does notgenerate a measurable signal, and therefore a marker must be used. Many of the recently developed immunoelectrodes use anoxidoreductase enzyme marker. Apart from the marker, it is alsonecessary to use a redox mediator in order to transfer the redox chargebetween the electrode and the redox sites and to detect the enzymeactivity through the mediator signal. The electrode surface has twodifferent functions: as inert substrate for the antibodies and asenzymatic detection transducer. Self assembled multilayers of PAH-Os and an antibody, IgGantibiotin, were constructed in order to develop a biosensor for thedetection of small molecules such as biotin through a competitiveassay, using an enzymatic marker or conjugate: horseradishperoxidase-biotin (HRP-biotin). By use of the QCM technique it waspossible to investigate the adsorption of IgG in the multilayers, theviscoelastic changes during the protein uptake, the adsorption kineticsfor different antibody concentrations and the conjugate adsorption. Thestructure and orientation of the IgG molecules on the polymer modifiedsurface were studied with AFM. And finally the growth of the layers andthe utility of the superstructure as biosensor were studied withelectrochemical techniques. Preliminary results of the use of binding proteins like protein Aand protein G’, used in order to improve the immunological reaction,were also described. In conclusion, the obtained results confirm that the biomoleculeimmobilization is one of the most critical stages in the development of abiosensor, since it affects the biosensor use and response. It has alsobeen shown the need for the use of different complementary techniquesin order to characterize the construction of self-assembled multilayers.

Citación:

---------- APA ----------

Otero, Marcelo Javier. (2003). Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3562_Otero

---------- CHICAGO ----------

Otero, Marcelo Javier. "Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3562_Otero

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