Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Influencia de las proteínas de la matriz extracelular sobre la morfología y funcionalidad de las células de Leydig de rata adulta |
| Autor: | Díaz, Emilce Silvina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Facultad de Medicina. Centro de Investigaciones en Reproducción
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2003 |
| Fecha en portada: | 2003 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Biología |
| Director: | Denduchis, Berta |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
biología/reproducción
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3555_Diaz |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3555_Diaz.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3555_Diaz |
| Ubicación: | BIO 003555 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Díaz, Emilce Silvina. (2003). Influencia de las proteínas de la matriz extracelular sobre la morfología y funcionalidad de las células de Leydig de rata adulta. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3555_Diaz |
Resumen:
Está ampliamente aceptado que las proteínas de la matriz extracelular (MEC)intervienen en la regulación de la diferenciación, morfogénesis, proliferación y migracióncelular. La mayor parte de las interacciones célula-MEC están mediadas por las integrinas,las cuales regulan a su vez, la reorganización del citoesqueleto, el transporte intracelular deiones, el metabolismo de los lípidos, la activación de quinasas y la expresión génica. Asimismo, en la última década se ha demostrado que las integrinas ejercen un papelimportante en los procesos reproductivos, incluyendo la fertilización, implantación yembriogénesís. En el testículo, la regulación de distintos procesos como el desarrollo, ladiferenciación y la esteroidogénesis de las células de Leydig, depende de la acciónconcertada de las hormonas gonadotróficas y de una gran variedad de factores localesproducidos de manera autocrina o paracrina. A pesar de lo mencionado en el párrafoanterior, son pocos los estudios realizados que intentan dilucidar el papel que ejercen lasproteínas de la MEC sobre la funcionalidad de las células de Leydig. Estas células estánrodeadas por proteínas de la MEC organizadas como una membrana basal continua odiscontinua. El objetivo de esta tesis fue estudiar la influencia de las proteínas de la MEC sobrela morfología, la adhesión celular, la expresión de integrinas y la esteroidogénesis de lascélulas de Leydig . Como modelo experimental, se utilizó el cultivo de células de Leydig derata adulta, utilizando como sustrato, la laminina-l, el colágeno tipo IV y la fibronectina. Nosotros observamos que las células de Leydig cultivadas sobre laminina-l,colágeno tipo IV y fibronectina, presentan un mayor número de prolongacionescítoplasmáticas que las cultivadas sobre vidrio. Asimismo, demostramos que la adhesión delas células al sustrato es un fenómeno que ocurre rápidamente y que el grado de adhesión alas mismas varía según el sustrato al cual se adhieren. Además, observamos que si bien las integrinas se expresan de manera constitutivaen las células de Leydig, su expresión aumenta en respuesta a la adhesión de las células alas proteínas de la MEC. Con respecto al efecto de las proteínas de la MEC sobre la capacidadesteroidogénica de las células de Leydig, demostramos que el colágeno tipo IV y lafibronectina inhiben la producción de testosterona de las células de Leydig de rata adulta,tanto en condiciones basales como estimuladas con hCG y que este fenómeno no se debe aun efecto citotóxíco. En cambio, la laminina-l utilizada como sustrato, no ejerció un efectomodulador sobre la producción de testosterona. En relación al mecanismo de la esteroidogénesis, demostramos que el efectoinhibitorio del colágeno tipo IV y la fibronectina ocurre en un paso posterior a laproducción de AMPc y anterior a la entrada del colesterol a la membrana mitocondrialinterna. Por otra parte, demostramos que el colágeno tipo IV es capaz de modular laexpresión de la proteína StAR, involucrada en el transporte del colesterol a la membranamitocondrial interna. Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió analizar alguna de las vías deseñalización intracelular activadas por el colágeno IV, capaces de regular negativamente laesteroidogénesis de las células de Leydig. Demostramos que la modulación negativa delcolágeno tipo IV sobre la esteroidogénesis de las células de Leydig de rata está mediada porla activación de tirosina quinasas. En particular, detectamos que la interacción del colágenotipo IV con las integrinas de la subfamilia β1, activa la cascada de Ras/MEK/ERK, siendoestas las responsables de la modulación negativa del colágeno tipo IV sobre laesteroidogénesis. Asimismo demostramos que las proteínas ERK 1-2 están involucradas enlas adhesiones focales inducidas por la interacción de las integrinas de las células de Leydigcon las proteínas de la MEC. Las integrinas tienen la capacidad de activar la vía de señalización de las MAPK através de distintos mecanismos. Uno de ellos, ocurre a través de la activación de lasproteínas Ras, pudiendo ser dependiente o no de la proteína FAK. Nosotros demostramosque en las células de Leydig de rata, la activación de la cascada de las MEK, inducida porel colágeno tipo IV, se desencadena fundamentalmente, a través de un mecanismo FAKindependiente. La activación de las proteínas ERK l-2 independiente de FAK, podría estarmediada por una proteína denominada caveolina-1. Nosotros identificamos la proteínacaveolina-1 en las células de Leydig y detectamos que su fosforilación es modulada por lainteracción del colágeno tipo IV con las integrinas de la subfamilia β1. Por otro lado, observamos que la expresión de la proteína StAR (“steroidogenicacute regulatory”) no solo es modulada por la vía de señalización del receptor de LH/hCG,sino que en su regulación participan las MAPK, en particular las MEK 1-2. Asimismo,demostramos que si bien el colágeno tipo IV, a través de las integrinas, es el principalresponsable de la activación de las proteínas ERK 1-2, PKA también interviene en lafosforilación de las mismas, siendo capaz de modular la cascada de señalización de las MAPK en las células de Leydig de rata estimuladas con hCG. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo, nos demuestran que lasproteínas de la MEC, son capaces de modular la adhesión, la diferenciación celular y laexpresión de integrinas. El colágeno tipo IV, a través de la interacción con las integrinas dela subfamilia β1 y mediante un mecanismo FAK independiente, activa a las proteínas ERK 1-2, las cuales regulan negativamente la expresión de la proteína StAR, inhibiendo laproducción de testosterona. Además, observamos que el estímulo de LH/hCG al aumentarla producción de AMPc, activa a la PKA, la cual interacciona con la cascada deseñalización de las MAPK, ejerciendo una regulación dual sobre la esteroidogénesis en lascélulas de Leydig de rata adulta Los resultados presentados en esta tesis contribuyen a ampliar los conocimientossobre la influencia que las proteínas de la matriz extracelular ejercen sobre la morfología ydiferenciación de las células de Leydig. Demuestran además, que el colágeno tipo IV, escapaz de modular, in vitro, la esteroidogénesis de las células de Leydig de la rata adulta.
Abstract:
It is well known that extracellular matrix (ECM) proteins are involved in theregulation of the differentiation, morphogenesis, proliferation and migration ofcells. Most cell-ECM interactions are mediated by integrins, which in turn regulatethe reorganization of the cytoskeleton, intracellular transport of ions, lipidmetabolism, activation of kinases and genic expression. In the last decade, integrinshave also been shown to have an important role in reproductive processes includingfertilization, implantation and embryogenesis. In the testis, the regulation of different processes as the development,differentiation and steroidogenesis of Leydig cells depends on the concerted actionof gonadotrophic hormones and a large variety of local factors produced in anautocrine or paracrine way. In spite of the information in the paragraph above, fewstudies have attempted to elucidate the role of ECM proteins in the functioning of Leydig cells. These cells are surrounded by ECM proteins organized as acontinuous or discontinuous basement membrane. The objective of this thesis was to study the influence of ECM proteins onthe morphology, cell adhesion, integrin expression and steroidogenesis of Leydigcells. The experimental model used was the culture of adult rat Leydig cells, usinglaminin-1 , type IV collagen and fibronectin as substrates. We observed that the Leydig cells cultured on laminin-1, type IV collagenand fibronectin present a larger number of cytoplasmic processes than thosecultured on glass. We also demonstrated that the cells adhesion to the substrateoccurs rapidly and that their degree of adhesion varies depending on the substrate towhich they adhere. We also observed that, although integrins are constitutively expressed in Leydig cells, their expression increases in response to the adhesion of the cells to ECM proteins. In relation to the effect of ECM proteins on steroidogenesis, wedemonstrated that type IV collagen and fibronectin inhibit the production oftestosterone of the Leydig cells of adult rat, both in basal conditions and whenstimulated with hCG, and that this phenomenon does not result from a cytotoxiceffect. On the other hand, laminin-1 used as substrate had no modulatory effect ontestosterone production. With respect to the mechanism of steroidogenesis, we demonstrated that theinhibitory effect of type IV collagen and fibronectin occurs after AMPc productionstep and before the entry of cholesterol into the internal mitochondrial membrane. We also demonstrated that type IV collagen is able to modulate the expression ofthe StAR (steroidogenic acute regulatory) protein, involved in the transport ofcholesterol to the internal mitochondrial membrane. In view of these results, we decided to analyze some of the intracellularsignal pathways, activated by collagen IV and able to negatively regulate thesteroidogenesis of Leydig cells. We demonstrated that the negative modulation oftype IV collagen on the steroidogenesis of rat Leydig cells is mediated by theactivation of tirosine kinases. In particular, we found that the interaction of type IVcollagen with β1 subfamily integrins activates the Ras/MEK/ERK cascade, thesebeing responsible for the negative modulation of type IV collagen insteroidogenesis. We also demonstrated that ERK 1-2 proteins are involved in thefocal adhesions induced by interaction between Leydig cell integrins and ECMproteins. Integrins have the capacity to activate the MAPK signal pathway throughdifferent mechanisms. One of these occurs through the activation of Ras proteins,and may or may not depend on the FAK protein. We demonstrated that in rat Leydig cells, the activation of the MEK cascade induced by type IV collagen istriggered basically through an independent FAK mechanism. The activation of the ERK 1-2 proteins independent of FAK could be mediated by a protein: caveolin-l. We identified the caveolin-l protein in the Leydig cells and found that itsphosphorilation is modulated by the interaction of type IV collagen with β1subfamily integrins. We also observed that the expression of the StAR protein is not onlymodulated by the signal pathway of the LH/hCG receptor, but that the MAPKparticipate in its regulation, particularly MEK 1-2. We also demonstrated thatalthough type IV collagen, through the integrins, is the main factor in the activationof ERK 1-2 proteins, PKA also intervenes in their fosforilation and is able tomodulate the MAPK signal cascade in rat Leydig cells stimulated with hCG. In conclusion, the results of this work demonstrate that ECM proteins areable to modulate adhesion, cell differentiation and integrin expression. Type IVcollagen, through interaction with β1 subfamily integrins and by an independent FAK mechanism, activates the ERK 1-2 proteins that negatively regulate expressionof the StAR protein, inhibiting testerosterone production. We also observed that LH/hCG stimulation, by increasing AMPc production, activates PKA; interactingwith the MPAK signal cascade, exerting dual regulation on the steroidogenesis ofadult rat Leydig cells. The results presented in this thesis contribute knowledge of the influence ofextracellular matrix proteins on the morphology and differentiation of Leydig cells. They also show that type IV collagen is capable of modulating, in vitro, thesteroidogenesis of adult rat Leydig cells.
Citación:
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Díaz, Emilce Silvina. (2003). Influencia de las proteínas de la matriz extracelular sobre la morfología y funcionalidad de las células de Leydig de rata adulta. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3555_Diaz
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Díaz, Emilce Silvina. "Influencia de las proteínas de la matriz extracelular sobre la morfología y funcionalidad de las células de Leydig de rata adulta". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3555_Diaz
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