Modulación del infiltrado inflamatorio en el desarrollo tumoral : efecto de citoquinas y estudio de la angiogénesis

Gazzaniga, Silvina N.

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Modulación del infiltrado inflamatorio en el desarrollo tumoral : efecto de citoquinas y estudio de la angiogénesis
Título alternativo:	Modulation of inflammatory infiltrate in tumor development, effect of cytokines and study of angiogenesis
Autor:	Gazzaniga, Silvina N.
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Química Biológica
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2003
Fecha en portada:	2003-03
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Director:	Wainstok, Rosa; Mordoh, José
Idioma:	Español
Palabras clave:	INFILTRADO INFLAMATORIO; GM-CSF; NECROSIS; MCP-1; MACROFAGOS; ANGIOGENESIS; CELULAS ENDOTELIALESINMMATORY INFILTRATE; GM-CSF; NECROSIS; MCP-1; MACROPHAGES; ANGIOGENSIS; ENDOTHELIAL CELLS
Tema:	biología/biología molecular y celular biología/biomedicina biología/fisiología animal
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3544_Gazzaniga
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3544_Gazzaniga.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3544_Gazzaniga
Ubicación:	Dep.QUI 003544
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Gazzaniga, Silvina N.. (2003). Modulación del infiltrado inflamatorio en el desarrollo tumoral : efecto de citoquinas y estudio de la angiogénesis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3544_Gazzaniga

Resumen:

Existen evidencias que tanto las células endoteliales presentes en la vasculatura deun tumor como las propias células tumorales liberan factores que promueven lamutua proliferación. Asimismo, los leucocitos que llegan al sitio tumoral atraídospor estímulos quimiotácticos pueden contribuir de manera importante a laprogresión o regresión del tumor, lo que pone de manifiesto un alto grado dedependencia entre estos tres grupos celulares. El objetivo de este trabajo de Tesis fue investigar la interrelación entre las célulasendoteliales (CE) y las células inflamatorias responsables de la inmunidad innataen el desarrollo tumoral. Para ello, se estudió el desarrollo de la neovascularizaciónen tumores mamarios murinos de distinto comportamiento biológico,observándose que el tipo histológico (lobulillar o ductal) no guarda relación conningún perfil angiogéníco particular. Sin embargo, se encontró que la tasa decrecimiento y la capacidad de producir metástasis están acompañadas por undesarrollo microvascular más activo. Esto evidencia un comportamiento de valor pronóstico como lo observado paratumores humanos y destaca la utilidad del anticuerpo monoclonal MEC 13.3 anti-CD31. Este mismo anticuerpo se utilizó acoplado a esferas inmunomagnéticas parael aislamiento de CE de tejidos normales y neoplásicos con el objeto de establecerlíneas que permitan estudiar la heterogeneidad fenotípica y funcional de las CE. Sibien no se logró reproducir el microambiente tumoral en cultivo para perpetuar elcrecimiento in vitro de las CE derivada de tumores, se logró establecer una línea de CE derivadas de tejido normal renal. Características como la expresión de CD31,moléculas de adhesión como VCAM-1, ICAM-1 y ELAM-1, expresión del factor devon Willebrand, la captación con avidez de LDL acetílado y la sensibilidad a Shigatoxina-1 (13-20%) definen el perfil de la que es hasta el presente la primeralínea descripta de endotelio microvascular renal murino. La vasculatura no sólo provee perfusión de oxígeno y nutrientes al tumor, sino quepermite la llegada y extravasación de células inflamatorias que según suscaracterísticas pueden tener efectos positivos o negativos en el desarrollo tumoral. Con el objeto de estudiar y modular el aflujo de células inflamatorias al tumor, seanalizó si la generación de necrosis por crioterapia en melanomas, a partir deldaño producido en las células tumorales, podría inducir la llegada de célulasinflamatorias al sitio y particularmente de células presentadoras de antígenos. Se encontró que la inducción de necrosis por crioterapia (77-100% de la masatumoral) en melanomas humanos (IIB-MEL-J) crecidos en ratones nude produjoactivación temprana del endotelio y una rápida llegada de célulaspolimorfonucleares (PMN) al sitio tumoral, seguidos del reclutamiento más tardíode macrófagos que persistieron hasta 15 días después del tratamiento. Estasmanifestaciones condujeron a la formación de un infiltrado peritumoral muyimportante pero sin infiltración intratumoral. La administración intralesional deuna dosis de 500U de la citoquina GM-CSF aumentó el infiltrado intratumoral demacrófagos y PMN post tratamiento. El aumento en el número de célulasdendríticas (DEC205+) y su movilización a capas más profundas de la dermiscercanas a las zonas peritumorales, además de la formación de anticuerpossugieren que la necrosis inducida con la crioterapia y la adyuvancia con GMCSFpueden resultar una estrategia útil para aumentar el infiltrado intratumoral. Lograr la llegada de células presentadoras de antígenos DEC 205+ y macrófagos F4/80+ al tumor podría contribuir a captar los antígenos liberados durante lanecrosis para ser llevados a los ganglios cercanos para la presentación antigénica. A las 4 hs de la administración de GM-CSF, la citoquina es retenida en el tumorcuatro veces más que la inyectada subcutáneamente, lo que podría contribuir alreclutamiento intratumoral observado. El melanoma utilizado en estos estudios secreta cantidades no detectables (inferiores a 12 pg/ml) de la quemoquina MCP-1 (monocyte chemotactic protein),una de las principales responsables de conducir a la formación de infiltradosmonocito/macrofágicos en tumores. En biopsias de melanomas metastásicoshumanos encontramos que 100% de ellos producen MCP-1 con variada intensidadde expresión y número de células positivas. La intensidad de expresión secorrelacionó con la vascularización, sugiriendo un efecto directo de la quemoquinasobre la angiogénesis. La presencia de importantes focos de macrófagos infiltrantesdentro del tumor se encontró particularmente asociada a áreas de activaangiogénesis pero no asociado a estructuras vasculares de gran calibre. Esto podríaser un indicio de la ruta de extravasación de los macrófagos frente al estimuloquimiotáctico o a un efecto proangiogénico de los macrófagos reclutados. Paradisponer de un modelo que nos permita estudiar mejor el rol de los macrófagosinfiltrantes al tumor, se transfectó la línea IIB-MEL-J con el cDNA correspondienteal MCP-1 humano, obteniéndose así una línea que produce 940 pg/ml/10^6células/48 hs. Las células transfectadas son de menor tamaño, mayor capacidadmigratoria frente a medios condicionados ricos en componente de matriz, menoradhesión al endotelio y no presentan diferencias en la tasa de crecimiento in vitro. Los tumores producidos por inyección subcutánea de las células productoraspresentan un infiltrado de macrófagos tanto intra como peritumoralsignificativamente mayor que los tumores parentales, hasta 30 días de lainoculación de las células. Sin embargo, son similares en tamaño a los originadospor la línea parental, lo que sugeriría que, a diferencia de otros modelosexperimentales, la presencia de macrófagos es necesaria pero no suficiente parainducir regresión, para la cual se requeriría de la respuesta efectora, ausente enratones nude. Por lo tanto, hemos generado un modelo muy interesante que nospermitirá continuar con el estudio del rol de los macrófagos y extrapolar losensayos de modulación del infiltrado con GM-CSF en tumores productores de MCP-1.

Abstract:

There is growing evidence that vascular endothelial cells as well as tumor cellsproduce factors that reciprocally promote proliferation. In addition, leukocytesarriving to the tumor site attracted by chemotactic stimuli may contributeimportantly to tumor progression or regression, which highlights the biginterdependence among these three cellular groups. The objective of this Thesis was to investigate the interplay among endothelial cells (EC) and inflammatory cells responsible of innate immunity in tumordevelopment. For this purpose, neovascularization analysis performed in micemammary tumors with different biological behaviour showed that the histologicaltype (lobular or ductal) was not related to any particular angiogenic profile. However, an elevated microvascular density accompanied tumor growth rate andthe ability to produce metastasis. The prognostic value of angiogenesis resemblesthe one described for human tumors and underlines the use of the monoclonalantibody against CD31 (MEC 13.3) as a useful tool for this kind of studies. Thesame antibody was coupled to immnunomagnetic beads for EC isolation fromnormal and neoplastic tissues with the purpose of establishing EC lines, whichcould allow the study of phenotypic and functional heterogeneity in ECpopulation. Even when it was not possible to reproduce the tumormicroenvironment in culture to allow tumor-EC growth in vitro, the establishmentof a line derived from normal renal tissue was accomplished. Characteristics like CD31 and VCAM-1, ICAM-1 and ELAM-1 expression, presence of von Willebrandfactor, avid uptake of acetylated LDL particles and Shigatoxin susceptibility (13-20%)are some of the features of the first murine microvascular renal EC linedescribed to the present. Vascularization provides oxygen and nutrient perfusion to tumors but is also theroute for inflammatory cells arrival and extravasation, whose presence couldinfluence positively or negatively on tumor fate. In order to study and modulatethe affluence of inflammatory cells to the tumor, cryosurgery-induced necrosis wasgenerated in melanomas assuming that the tumor cells debris and released factorscould trigger the affluence of inflammatory cells, particularly antigen presentingcells. We found that cryosurgery-induced necrosis (77-100% of tumor mass) in humanmelanomas (lIB-MEL-J) xenografted in nude mice produced early activation ofendothelium and a quick infiltrative response of PMN, followed by a latterresponse of macrophages, which persisted until 15 days after treatment. Theseevents drove to the formation of very important peritumoral infiltrates but scarseintratumoral inflammatory cells. Intralesional application of a single 500U dose ofthe cytokine GM-CSF to cryotreated tumors augmented macrophages and PMNintratumoral infiltration after treatment. The increase of DEC205+-dendritic cellsand their mobilization to deeper layer of the dermis close to the peritumoral areas,besides antibody formation, suggest that cryosurgery-induced necrosis and theadjuvancy with GM-CSF could be a useful strategy to increase intratumoralinfiltration. Eliciting the affluence of antigen-presenting cells DEC205+ and F4/80+macrophages to the tumor site could contribute to the capture of the releasedantigens during necrosis and its presentation in draining lymph nodes. At 4h after administration, retention of GM-CSF in the tumor was four-fold higherthan when injected subcutaneously, which could contribute to the intratumoralinfiltration registered. The melanoma cells employed in these studies produced undetectable levels (lower than 12 pg/ml) of MCP-1 chemokine, one of the main chemokinesresponsible to recruit monocyte/macrophages to tumors. We found that 100% ofhuman metastatic melanomas biopsies were positive for MCP-1, expressed avariable number of cells and with different intensities. Expression of MCP-1correlated with vascularization, suggesting an effect of the chemokine onangiogenesis. The important presence of macrophages infiltrating the tumor wasparticularly associated with areas of dense microvascular structures rather thanwith vessels of larger caliper. This could give an indication of the route ofextravasation followed by macrophages attracted by the chemotactic stimulus, oralternatively be the effect of proangiogenic macrophages recruited. To develop amodel which allowed us to study in further detail the role of infiltratingmacrophages to tumor, IIB-MEL-J melanoma line was transfected with cDNA ofhuman MCP-1, obtaining a line which produced 940 pg/ml/10^6 cells/48 h. Thetransfected cells were smaller, had an increased migratory capacity to rich-in-matrix-components conditioned supernatants and less adhesive to endothelium. They did not present differences in in vitro growth rate. Tumors generated by thesubcutaneous injection of MCP-1-producing cells showed significantly higherperitumoral and intratumoral infiltrates with respect to parental tumors until 30days after cell inoculation. Nonetheless, the tumors were similar in size to thoseoriginated from the parental cells, what could suggest the absence of an effectorresponse in nude mice. Consequently, we have generated an interesting model,which will allow us to pursue the studies on the role of macrophages and themodulation of infiltrates with GM-CSF in MCP-1-producing tumors.

Citación:

---------- APA ----------

Gazzaniga, Silvina N.. (2003). Modulación del infiltrado inflamatorio en el desarrollo tumoral : efecto de citoquinas y estudio de la angiogénesis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3544_Gazzaniga

---------- CHICAGO ----------

Gazzaniga, Silvina N.. "Modulación del infiltrado inflamatorio en el desarrollo tumoral : efecto de citoquinas y estudio de la angiogénesis". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2003.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3544_Gazzaniga

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