Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria |
| Título alternativo: | Progesterone receptor (RP) expression and functionality in the modulation of hormone-dependent growth and in the acquisition of resistance to hormonal treatment in a model of murine mammary carcinogenesis |
| Autor: | Helguero, Luisa Alejandra |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Instituto de Biologia y Medicina Experimental (IByME). Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2002 |
| Fecha en portada: | 2002 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Biología |
| Director: | Molinolo, Alfredo A. |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/endocrinología
biología/biomedicina
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3495_Helguero |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3495_Helguero.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3495_Helguero |
| Ubicación: | BIO 003495 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Helguero, Luisa Alejandra. (2002). Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3495_Helguero |
Resumen:
El cáncer de mama es la segunda causa de muerte en las mujeres, luego del cáncer de pulmón. En eldesarrollo de esta enfermedad se postulan distintas etapas biológicas que van progresando desde uncrecimiento hormono-dependiente a uno hormono-independiente, lo que está asociado a un aumento de laagresividad. En la clínica, si el tumor expresa receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), una parteimportante de los enfoques terapéuticos de elección, es la hormonoterapia con el antiestrógeno tamoxifeno. Sin bien en un principio la gran mayoría de los pacientes responden, con frecuencia el tumor evolucionahacia la resistencia al tratamiento hormonal, lo que se asocia a diseminación generalizada. Esta resistencia,cuyos mecanismos aun se desconocen, no implica en general una pérdida de expresión de receptoreshormonales y todo parece indicar que, o bien existe un cambio intrínseco en éstos, o en los mecanismos queregulan su expresión y activación. En nuestro laboratorio desarrollamos un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos por laadministración prolongada de MPA en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Estos tumores son en sumayoría de origen ductal con capacidad invasora. En un principio poseen un comportamiento progestágeno-dependiente (PD), requiriendo de la hormona trófica para su crecimiento y expresan RE y RP, pero con eltiempopueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, en el cual se conserva aún la expresión dereceptores. Previamente hemos demostrado que el RP estaria involucrado en la adquisición de hormonodependencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el papel del RP en la transición de hormono-dependencia aindependencia y en la adquisición de resistencia hormonal. Para este estudio utilizamos seis tumores PD ynueve progestágeno-independientes. Caracterizamos la respuesta in vivo de los tumores independientes al tratamiento con losantiprogestágenos onapristona y mifepristona y al 17-β-estradiol. Seis tumores respondieron regresionando, ylos llamarnos progestágeno-independientes respondedores (PI-NR) y tres no respondieron; a éstos losdenominamos progestágeno-independientes no respondedores (PI-NR). En nuestro laboratorio ya se habíaevaluado la respuesta in vivo de los tumores PD, y respondieron a estrógenos y antiprogestágenos conregresión. Cuando, en cultivos primarios de un tumor PD, estudiamos la respuesta proliferativa a MPA in vitroobservamos que la misma fue bifásica, con dos pendientes estimulatorias, una a concentraciones muy bajas (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM) y la otra a concentraciones más altas (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Con estos resultados,evaluamos por unión del ligando la expresión de receptores en todos los tumores y en tejidos normales. Enútero normal, y en tumores PD y PI-R, descubrimos dos sitios receptores de progesterona, uno de altaafinidad no descrito previamente en el RP (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de proteína) y el otro sitioclásico que habíamos hallado previamente (Kd= 9.2 ± 4 nM). En los tumores PI-NR no se pudieron determinarestos parámetros. El estudio de la distribución subcelular de RP mostró que en los tumores PD y PI-R selocalizan principalmente en el citosol, y son regulados por MPA, mientras que en los tumores PI-NR estánprincipalmente en el núcleo y no son regulados. Sin embargo, durante el ciclo estral, los sitios receptores sonregulados en todos los tipos de tumor estudiados. Para caracterizar la expresión de las isoformas del RP utilizamos Western blot. En los tumores PD y PI-R se encontraron ambas isoformas, RPa y RPb, con patrón de expresión similar al de los controlesnormales, útero y mama de ratón. Encontramos además, una proteína de 78 kDa que se expresaexclusivamente en los tumores, pero no en los tejidos normales. Desconocemos su naturaleza, pero se hadescrito una proteína similar en un 25 % de tumores humanos. Su ausencia de tejidos normales sugiere unaposible aplicación como marcador tumoral. Con MPA, ambas isoformas RPA y RPB se regulan negativamenteen forma similar. En los tumores PI-R se regula preferencialmente RPb, esto sugeriría un papel del RP en estetipo de crecimiento en particular por RPb. En los tumores PI-NR se detectaron menores niveles de RP, principalmente de RPb. Por estudios de Western Blot se podría predecir la capacidad de los tumores de responder al tratamiento hormonal. Por inmunohistoquímica, no se observaron diferencias en el patrón de marcación entre los tres tiposde tumores. Todos fueron positivos, con un porcentaje de células marcadas del 50 % o más. Los resultados de SSCP indican que la reactividad diferencial de los anticuerpos con Western blot e inmunohistoquímica no sedebe a mutaciones en el gen de RP. Hemos teorizado la posibilidad de cambios de expresión de epitopessecundarios al distinto procesado de los tejidos en las técnicas. La caracterización de ARN por protección a RNasa indica que los niveles de RP en tumores PI-R y PI-NR sonsimilares. Es probable que, en los tumores PI-NR, las diferencias de expresión observadas con Westernblot se deban a cambios post-traduccionales. Con oligonucleótídos antisentido del RP (asRP) en cultivos primarios de tumores PI-NR demostramosque los RP están involucrados en la proliferación celular aún cuando han perdido la capacidad de unir alantiprogestágeno. Estos resultados, de ser extrapolables al humano indicarían que, en el tratamiento delcáncer de mama resistente a la terapia hormonal aún se podrían utilizar estrategias diseñadas a bloquear lafuncionalidad de los receptores hormonales.
Abstract:
Breast cancer is, after lung cancer, the second cause of death in women. The development ofthis disease occurs through different stages from a hormone-dependent to a hormone-independentgrowth, which is associated to increased aggressiveness. One of the treatments of choice for ER and PRpositive breast cancer is hormone therapy with the antiestrogen tamoxifen. Most of the patientsrespond, although eventually the tumor becomes refractory and the disease progresses. Themechanisms of resistance remain unknown, but most tumors still express hormone receptors, indicatingthat there is either an intrinsic modification on these molecules, or in the regulation of theirexpression and activation. In our laboratory, we have developed a murine mammary adenocarcinoma model by prolongedadministration of MPA on female virgin BALB/c mice. Most of these tumors are invasive ductalcarcinomas, disclosing a progestin-dependent pattern of growth (PD) and they express ER and PR. Either spontaneously or by successive transplantations in animals not treated with hormones, progestin-independenttumors may arise that maintain the expression of hormone receptors. Our goal was to study the role of PR in the transition from hormone-dependence toindependence and in the acquisition of resistance to hormonal therapy. We characterized the in vivo response of progestin-independent tumors to the antiprogestinsonapristone and mifepristone and to 17-β-estradiol. Six tumors regressed, and we named themresponsive progestin-independent (R-PI); three did not respond and were named unresponsiveprogestin-independent tumors (UR-PI). We studied the proliferative response to MPA in vitro on primary cultures of a PD tumor, andobserved that it was biphasic, with two stimulatory slopes, one at very low concentrations (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM), and the other at higher concentrations (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Based on these results weevaluated the receptor expression by radioligand binding in all the tumors and normal tissues. Inuterus, PD and R-PI tumors, we discovered two sites for the progesterone receptor, one of high affinitynot previously reported (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de protein) and the other site whichcorresponds to the classical PR described by others (Kd = 9.2 ± 4 nM, Q = 376 ± 74 fmoles/mg deprotein). PR, in PD and R-PI tumors, are mainly localized in the cytosol, and are regulated by MPA,while in UR-PI tumors they are mainly in the nucleus and are not regulated by this hormone. Nevertheless, the receptor sites were regulated through the estral cycle in all the tumor types studied. To characterize PR isoform expression we used Western blot. We found both PRa and PRbisoforms in PD and R-PI tumors, with a similar expression pattern compared to the control tissue uterusand normal mammary gland. We also found a 78 kDa protein which is exclusively expressed in tumorsbut not in normal tissue. Its nature remains unknown but a similar protein has been described in 25 %of human cancers. Its absence in normal tissues suggests a possible use as a tumor marker. With MPAtreatment, both PRa and PRb are down regulated. PRb is preferentially down regulated in R-PI tumorsand this may be indicating its role in this type of growth. Lower levels of PR were detected in UR-PItumors, particularly PRb. Based on the Western blot studies the ability of the tumors to respond tohormonal treatment could be predicted. PR expression was also studied by immunohistochemistry. No differences were observedbetween the staining patterns of the three tumor types. The signal was positive in 50% or more nuclei. We conclude based on the SSCP studies that the differential reactivity between the antibodies used in Western blot and immunohistochemistry is not due to mutations in the PR gene. We theorize thepossibility that these changes are product of modifications in the epitope expression due to theprocessing of the sample for each technique, or to post-translational changes. The studies at RNA level by RNase protection assay indicate that PR expression levels in R-PIand UR-PI tumors are similar. Probably, in UR-PI tumors the lower expression levels observed with Western blot are due to post-translational modifications. In primary cultures of UR-PI tumors, using antisense oligonucleotides to PR (asPR) wedemonstrated that PR are involved in cell proliferation even when they have lost their ability to bind tothe antiprogestagens. The importance of these observations relies in that, if these results to humansare possible to extrapolate to human, in the treatment of hormone resistant breast cancer strategiesdesigned to block the functionality of these receptors could still be used.
Citación:
---------- APA ----------
Helguero, Luisa Alejandra. (2002). Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3495_Helguero
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Helguero, Luisa Alejandra. "Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2002.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3495_Helguero
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