Sistemas supramoleculares organizados por ensamblado de capas monomoleculares de enzimas y polímeros rédox

Wolosiuk, Ricardo Alejandro

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Sistemas supramoleculares organizados por ensamblado de capas monomoleculares de enzimas y polímeros rédox
Título alternativo:	Supramolecular systems organized by self-assembly of redox polymers and monomolecular layers of enzymes
Autor:	Wolosiuk, Ricardo Alejandro
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física (DQIAQF)
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2002
Fecha en portada:	2002
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Departamento Docente:	Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Director:	Calvo, Ernesto Julio
Idioma:	Español
Palabras clave:	BIOSENSOR ENZIMATICO AMPEROMETRICO; AUTOENSAMBLADO ELECTROSTATICO; GLUCOSA OXIDASA; PEROXIDASA DE SOJA; MEDIACION REDOXENZYME AMPEROMETRIC BIOSENSOR; ELECTROSTATIC SELF-ASSEMBLY; GLUCOSE OXIDASE; SOYBEAN PEROXIDASE; REDOX MEDIATION
Tema:	química/electroquímica química/química analítica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3474_Wolosiuk
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3474_Wolosiuk.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3474_Wolosiuk
Ubicación:	QUI 003474
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Wolosiuk, Ricardo Alejandro. (2002). Sistemas supramoleculares organizados por ensamblado de capas monomoleculares de enzimas y polímeros rédox. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3474_Wolosiuk

Resumen:

Un biosensor constituye un dispositivo de reconocimiento molecular donde una macromolécula,generalmente de origen biológico interactúa con un analito en forma específica e inicia asi un proceso quese transduce en una señal eléctrica. Dentro de esta categoría podemos distinguir a los electrodosenzimáticos amperométricos, donde son medidos cambios de corriente eléctrica sobre un electrodo detrabajo a partir de variaciones en el estado rédox de un mediador que participa del proceso biocatalítico conla enzima rédox. La regeneración del estado rédox inicial del mediador sobre la superficie de un electrodo —aplicando potenciales apropiados — permite que se produzca un estado estacionario en la catálisis y porende una corriente eléctrica también estacionaria. Este flujo de electrones se halla correlacionado en formadirecta con el consumo del analito. El estudio de electrodos enzimáticos amperométricos ha estado tradicionalmente ligado a lainmovilización de las enzimas rédox en matrices poliméricas. Lamentablemente, estos sistemas integradospresentan dificultades para su estudio a escala molecular dadas por la complejidad y falta de control en laorganización espacial del biosensor. Esto impide un análisis microscópico de las variables que afectan larespuesta de estos biosensores tales como el espesor, la concentración de enzima y mediador rédox o lacinética de reacción entre la enzima rédox y el mediador. La presente tesis propone una estrategia para el diseño de electrodos enzimáticos amperométricospara su utilización como biosensores. Esto involucra el empleo de técnicas de autoensambladoelectrostático con el objetivo de depositar en forma altemada y secuencial la enzima rédox y el mediador. De esta manera es posible evaluar distintos parámetros de la película formada: la cantidad de enzimaadsorbida, empleando la microbalanza de cuarzo (QCM); los sitios rédox depositados, por medio detécnicas electroquímicas; el espesor, mediante elipsometría y la morfología de la superficie, utilizandomicroscopía de fuerza atómica (AFM). Por otra parte, es evidente que el grado de control en el diseño delelectrodo enzimático amperométrico permite analizar su respuesta en función de la estructura construida. En este contexto, se trabajó con dos enzimas rédox aniónicas: glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa de soja (SBP), mientras que se empleó polialilamina catiónica modificada con un complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+(PAH-Os) y un polielectrolito rédox globular de origen dendrítico, poliamidoaminamodificada con el mismos complejo (PAMAM-Os) como mediadores rédox. En una primera etapa, se estudió el efecto de la estructura electrostática sobre la respuestaelectroquímica de la PAH-Os. Dado que el film depositado es multi-bipolar, posee la propiedad de excluiriones por fuerzas electrostáticas repulsivas. En este sentido, el autoensamblado de PAH-Os conpolielectrolitos aniónicos como poliestirensulfonato (PSS) y polivinilsulfonato (PVS) permitió elaborar unmodelo de membrana permselectiva para analizar este comportamiento. Las cargas positivas - dadas porlos grupos amino - y negativas — dadas por los grupos sulfonato - determinan la aparición de un potencialde membrana que puede ser interpretado en términos del potencial de Donnan. De esta manera, ensoluciones de baja fuerza iónica, la permselectividad impuesta por este potencial se torna evidente y el tipode ion excluido depende de la identidad de la capa terminal y del pH de la solución, afectando el potencialformal de la cupla de PAH-Os en la estructura. Por otra parte, en soluciones de alta fuerza iónica, elpotencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura se aproxima al valor del complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+ en solución. El uso de la microbalanza de cuarzo electroquímica (EQCM) demostróla naturaleza de los iones intercambiados entre la película depositada y solución de electrolito en cada unade las situaciones descriptas anteriormente. Se reconocen tres procesos asociados en el diseño de un biosensor. Por un lado el mediador rédoxinmovilizado electrostáticamente sobre el electrodo debe intercambiar electrones con esta superficie. Enuna segunda etapa, la carga rédox debe propagarse a lo largo de las capas sucesivas. Finalmente, elmediador rédox debe alcanzar el grupo prostético rédox de la enzima para realizar la transferenciaelectrónica. De esta forma es posible transducir el proceso de reconocimiento molecular del sustratoefectuado por la enzima en una corriente catalítica. En particular, un aumento de la concentración delsustrato resultará en un incremento de la señal amperométrica. En el marco de los procesos que hemos identificado, estudiamos la influencia de la disposiciónespacial de la GOx adsorbida en una monocapa sobre la comunicación eléctrica entre el mediador y laenzima. En este contexto, mediante medidas de QCM, AFM y técnicas electroquímicas determinamos queel nivel de agregación de proteína sobre la superficie del electrodo incide de manera negativa en laconstante de velocidad aparente de la mediación catalítica de la PAH-Os en la oxidación del sustrato de la GOx, β-D-glucosa. Más aún, la cantidad de enzima que interactúa con el mediador es mucho menor a laenzima pesada por QCM. Sin embargo, al aumentar la relación de concentración superficial entre los sitiosde Os adsorbidos y la enzima depositada, se incrementaba tanto la cantidad de enzima “cableada” por la PAH-Os como así también la constante de velocidad aparente con el grupo FADH2 de la GOx. El mecanismo de transporte de carga rédox en el sistema PAH-Os / GOx fue estudiadointercalando una capa de GOx activa con capas de apoenzima inactiva, apo-GOx. Ubicando la capa reactivaa distancia variable del electrodo fue posible determinar el coeficiente de difusión de la carga rédox, De, enla estructura electrostática autoensamblada. El valor de De obtenido - en el orden de 10ˉ9 cm² sˉ¹ — implicaque el transporte de carga ocurre a través de un mecanismo de saltos electrónicos ya que la difusión fisicade las cadenas poliméricas de la PAH-Os se halla impedida. De esta manera, la construcción capa por capade estos electrodos permitió definir espacialmente el sistema y estudiar el transporte de carga rédox a lolargo de distancias nanométricas. La posibilidad de propagar la estructura en forma repetida y construir un sistema de multicapas de PAH-Os / GOx permitió establecer similitudes y diferencias entre las distintas capas depositadas. Enparticular, se encontró que la primer bicapa de PAH-Os / GOx difiere notablemente del resto que le siguendebido a que la PAH-Os interactúa con la enzima únicamente por “debajo”. Por otra parte, al aumentar elpH desde donde se adsorbía la solución de PAH-Os las cantidades de enzima y carga rédox depositadaseran mayores. Esto es debido a que el polielectrolito rédox tiende a adoptar una conformación que exponeuna mayor proporción de segmentos poliméricos sobre la superficie que inducen la agregación de enzimas. Si bien la proporción de enzimas que reaccionan con la PAH-Os es mayor en este caso, la constante develocidad permanece relativamente invariable. Exploramos también el uso de un mediador rédox globular de origen dendrítico, PAMAM-Osautoensamblado con la enzima GOx. Los estudios elipsométricos indicaron un ligero comportamientoelástico del dendrímero modificado al adsorberse en forma electrostática sobre una superficie. Más aún, sibien se encontró que la PAMAM-Os participa activamente en el proceso de catálisis de oxidación de laglucosa se encontraron dificultades para definir la concentración volumétrica de sitios de Os en el film. Finalmente, el autoensamblado electrostático permitió analizar la comunicación eléctrica entre la PAH-Os y SBP que posee un centro prostético constituido por un grupo hemo y reduce H2O2 a expensas delos sitios de PAH-Os reducidos. Por otra parte, dado que la GOx en presencia de O2 oxida la glucosaproduciendo H2O2, se ensayó un esquema bienzimático donde se depositaron capas de SBP intercaladascon PAH-Os y una capa de GOx en el tope de la estructura. Trabajando a potenciales reductores se registró la respuesta amperométrica debida a la formación de peróxido de hidrógeno por la capa de GOx. En estesentido se logró definir con precisión de nanometros las distintas capas reactivas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que el estudio de electrodos enzimáticosamperométricos autoensamblados electrostáticamente constituye una poderosa herramienta para analizardistintos aspectos relacionados a la transferencia electrónica entre enzimas y el mediador rédox, losmecanismos de propagación de electrones en sistemas químicos integrados y la distribución espacial dearreglos multienzimáticos.

Abstract:

A biosensor is a molecular recognition device where a biological macromolecule interacts with ananalyte in a unique way that triggers a series of events that are finally transduced in an electrical signal. Among this category we can distinguish the enzymatic amperometric electrodes, where an electrical currentis measured over a working electrode due to changes in the redox state of a mediator that panicipates in thebiocatalytical process. The regeneration of the initial redox state of the mediator over the surface of theelectrode — applying appropiate potentials - results in a catalytic steady state and so is the electrical current. This electron flux can be correlated to the analyte consumption. The study of enzymatic amperometric electrodes has always relied in the immobilization of theredox enzymes in a polymer matrix. Unfortunately, this integrated systems present difficulties in their studyat a molecular scale because of their complexity and lack of spatial organization of the biosensor. Thisprevents a microscopic study of the variables that affect the biosensor response, such as thickness, enzymeconcentration and redox mediator concentration or the kinetics between enzyme and mediator. In this thesis we propose a strategy for the design of biosensors based on cnzymatic amperometricelectrodes. This involves the use of the electrostatic self-assembly in order to adsorb the redox enzyme andmediator in a sequential and alternate process. Using this technique. it is possible to monito differentparameters of the sel-assembled system: the amount of enzyme adsorbed, with the quartz crystalmicrobalance (QCM); the redox sites deposited, can be obtained from electrochemical methods; the filmthickness, using ellipsometry and the surface morfology via the atomic force microscopy (AFM). Moreover, the spatial control in the design of the enzymatic amperometric electrode allows to study theperformance according to the structure built. In this context, we worked with two anionic redox enzymes:glucose oxidase (GOx) and soybean peroxidase (SBP), while as redox mediators we employed cationicpoly(allylamine) modified with an osmium complex. [Os(bpy)2ClpyCHO]¹, (PAH-Os) andpolyamidoamine modified with the same complex (PAMAM-Os). In a first stage, we studied the effect of the electrostatic structure on the electrochemical responseof the PAH-Os. Given that the film formed is multi-bipolar. ions can be rejected by repulsive electrostaticforces. In this way, the self-assembly of PAH-Os with anionic polyelectrolytes like poly(styrene) sulfonate (PSS) or poly(vinyl) sulfonate (PVS) allowed to model this behavior as a permselective membrane. Thepositive charges — given by the amino groups — and the negative charges — given by the sulfonate groups —develop a membrane potential that can be interpreted in terms of the Donnan theory. At low ionic strength Donnan permselectivity of anions or cations is apparent and the nature of the ion exclusion from the film isdetermined by the charge of the topmost layer and solution pH. On the other hand, at high electrolyteconcentration Donnan breakdown is observed and the osmium redox potential approaches the value for theredox couple in solution. The electrochemical quartz microbalance has been used to monitor the exchangeofions with the external electrolyte during redox switching. We can recognize three processes associated to the design of a biosensor. First, the electrostaticallyimmobilized redox mediator must exchange electrons with the electrode surface. Second, the redox chargemust travel along the successive immobilized layers. Finally, the redox mediator must reach the enzymeredox prosthetic group for electron transfer. This results in the transduction of the molecular recognition ofthe substrate by the enzyme and in an increase in the amperometric response. Having identified this series of processes, we studied the influence of the spatial distribution of amonolayer of GOx on the electrical communication between the mediator and the enzyme. QCM, AFM andelectrochemical studies have shown that the formation of enzyme aggregates on the surface of the electrodelowers the apparent rate constant of the catalytic redox mediation of PAH-Os in the substrate oxidation of GOx, β-D-glucose. Moreover, the amount of enzyme that interacts with the mediator is lower than theenzyme weighed by the QCM. However, increasing the ratio between the surface concentration of Osadsorbed and enzyme deposited increased the amount of enzyme “Wired” by the PAH-Os and the apparentrate constant between the redox mediator and the FADH2 prostethic group. The redox charge transport mechanism in the PAH-Os / GOx system has been studied varying therelative position of the active GOx enzyme layer with inactive apoenzyme layers, apo-GOx. In this orderwe were able to determine the diffusion coefficient of the redox charge, De, in the electrostatic self assembledstructure. The value of De obtained — in the order of lOˉ9 cm² sˉ¹ — implies that the chargetransport mechanism proceeds via electron hopping as the physical diffusion of polymeric strands of PAHOSis hindered. Therefore, the layer-by-layer construction of this electrodes allowed to spatially define thesystem and to analyze the redox charge transport along nanometric distances. The possibility to expand the structure in a repetitive way and to build a system comprised ofmultilayers of PAH-Os / GOx allowed to establish similarities and differences between the differentdeposited layers. We found that the first bilayer of PAH-Os / GOx differs from the following layers on topbecause the PAH-Os only interacts with the enzyme from “below”. In addition, the pH rise of the PAH-Ossolution resulted in larger amounts of enzyme and redox mediator deposited. Lowering the charge densityof the redox polyelectrolyte induced a surface conformation where more polymer segments are exposed tothe solution interface which in turn favored the enzyme aggregation. Despite that, in this case, the fractionof enzymes that react with PAH-Os is bigger the rate constant remains practically invariant. We also explored the use of a dendritic globular redox mediator. PAMAM-Os, self-assembled with GOx. Ellipsometric studies showed an elastic behaviour of the modified dendrimer when waselectrostatically adsorbed on a surface. Moreover, we found that PAMAM-Os readily participates in thecatalytic oxidation of glucose but the geometric distribution of the redox couple in the film makes difficultthe calculation of the volumetric concentration of redox sites. Finally, the electrostatic self-assembly offered the possibility to analyze the electricalcommunication between PAH-Os and SBP which has an heme prosthetic group. This enzyme and the PAH-Os in the reduced state converts H2O2 to water. On the other hand, it is known that GOx oxidizesglucose to H2O2 in the presence of O2; in this order a bienzymatic scheme was evaluated where layers of SBP were adsorbed with PAH-Os and a layer of GOx on top of the structure. Working at negativepotentials the production of H2O2 from the GOx layer was detected recording the amperometric response. In this sense, the precise nanometric control achieved the separation of the reactive layers. In conclusion, the results obtained suggest that the study of enzymatic amperometric electrodeselectrostatically self-assembled is a powerful tool for analyzing different aspects related to electron transferbetween enzymes and redox mediators, redox charge transports mechanisms in integrated chemical systemsand the spatial distribution of multienzyme arrays.

Citación:

---------- APA ----------

Wolosiuk, Ricardo Alejandro. (2002). Sistemas supramoleculares organizados por ensamblado de capas monomoleculares de enzimas y polímeros rédox. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3474_Wolosiuk

---------- CHICAGO ----------

Wolosiuk, Ricardo Alejandro. "Sistemas supramoleculares organizados por ensamblado de capas monomoleculares de enzimas y polímeros rédox". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2002.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3474_Wolosiuk

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