Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina |
| Autor: | Vilá Ortiz, Guillermo |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2002 |
| Fecha en portada: | 2002 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Santa Coloma, Tomás; Idoyaga Vargas, Víctor |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | FOSFATASAS DE SERINA Y TREONINA; DESARROLLO; CEREBELO; CULTIVOS CELULARES; CALCINEURINA; APOPTOSISSERINE/THREONINE PHOSPHATASES; DEVELOPMENT; CEREBELLUM; CELL CULTURES; CALCINEURIN; APOPTOSIS |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
biología/neurociencias
|
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3456_VilaOrtiz |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3456_VilaOrtiz.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3456_VilaOrtiz |
| Ubicación: | Dep.BIO 003456 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Vilá Ortiz, Guillermo. (2002). Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3456_VilaOrtiz |
Resumen:
El objetivo en esta tesis fue caracterizar el comportamiento de las fosfatasas de serinay treonina (STPasas) durante el desarrollo del sistema nervioso. Como modelo experimentalse empleó en primera instancia el desarrollo postnatal del cerebelo de ratón, ya que duranteeste período se dan numerosos procesos, como el crecimiento axonal, la formación desinapsis y la apoptosis, en los cuales las distintas STPasas podrían llegar a estar involucradas. Para caracterizar la expresión de los ARNm de las fosfatasas, se diseño una nueva estrategia, SSDD (Single-Strand Differential Display), la cual nos permitió determinar como era laexpresión de los distintos mensajeros a distintas edades. Esta técnica no solo nos permitióobservar que cada una de las STPasas detectadas presenta una expresión diferencial, sino quetambién identificar una nueva variante de splicing de la isoforma gamma de la PP1. Estatécnica también fue empleada con éxito para el estudio de STPsas en tumores del sistemanervioso, pudiéndose observar que tanto la expresión de la isoforma alfa de la PP1 como delas isoformas alfa y beta de la PP2A era mayor en tumores de índole maligna que enbenignos. Además, se detectó por primera vez la isoforma gamma de la calcineurina (CaN Aγ) en tumores del sistema nervioso. Durante el desarrollo del cerebelo, se observó que PP2A no muestra variacionessignificativas ni en la expresión de proteínas ni en la actividad fosfatasa que posee. Por otrolado, PP1 sí muestra diferencias no solo en la expresión de proteínas, donde se observa unaumento a P13 y una disminución posterior a P20, sino también en lo que respecta a suactividad, cuyo incremento coincide con el período en el cual se empiezan a formar lassinapsis entre los axones de las células grano y las espinas dendríticas de las células de Purkinje. En el mutante cerebeloso staggerer, en el cual se encuentran afectadas las célulasde Purkinje y no se produce la estabilización sináptica, se encontró que los niveles proteicosde PP1 no disminuyen a P20 como ocurre en el cerebelo normal, y que la actividad no seincrementaba. Por otro lado, la fosfatasa que mostró mayores variaciones durante eldesarrollo fue la calcineurina. Específicamente, los niveles de proteínas de la isoforma CaN Aα se incrementan gradualmente con el tiempo, lo cual coincide con el período de formaciónde sinapsis. En este período además, se produce un incremento en la actividad de lacalcineurina. En el mutante staggerer, los niveles de esta isoforma son similares hasta P11,pero después no se incrementan como sucede en el ratón normal. La actividad fosfatasa en elmutante decae también a partir de esta edad. Con el fin de estudiar con mayor detalle la función de la calcineurina, se estudió loque ocurría en distintos cultivos del sistema nervioso (células PC12, células NT2 y cultivosprimarios de células grano). Para esto se incubaron los distintos cultivos con inhibidores de lacalcineurina y con oligonucleótidos antisentido contra las dos isoformas. En todos los casosse observó que, tanto la inhibición de la actividad como de la expresión, particularmente de laisoforma CaN Aβ, provocaba que las células murieran por apoptosis, independientemente delestadío de diferenciación en el que ellas se encontraran. Este proceso estaba relacionado conun aumento en los niveles de Bax y una disminución de Bad. Particularmente en el caso delas células NT2, se pudo observar que el aumento de la expresión de Bax coincidía con unincremento en la translocación de la proteína al núcleo, mientras que la disminución de Badlo hacía con la aparición de “parches” en el citoplasma, lo que es indicativo de unatranslocación a mitocondria. Posteriormente se estudió lo que ocurría con estas proteínas pro-apoptóticas en elmutante staggerer, el cual presentaba una muy baja actividad de calcineurina. Bad no mostróvariaciones pero los niveles de Bax a P20 aumentaron considerablemente. Todos estosresultados sugieren que la inhibición de la expresión o de la actividad de la calcineurinaocasiona que las células entren en apoptosis por un mecanismo que involucra, por lo menos,un aumento en los niveles de Bax.
Abstract:
The objective of this work was to characterize the behavior of serine/threoninephosphatases (STPases) during development in the nervous system. As first approach, mousecerebellum postnatal development was employed as experimental model, because severalprocesses during this period, such as axonal growth, synapses formation and apoptosis, mightinvolved several STPases. A new method was developed, SSDD (Single-Strand Differential Display), to characterize mRNA expression of STPases, which allowed us to analyze theexpression of these messengers at different ages. Using this method, not only a differentpattern of mRNA expression was obtained but the identification of a new splicing form of PP1 gamma isoform was achieved. This technique was successfully applied to the study ofthe mRNA of STPases in tumors of the nervous system too, showing that the PP1 alpha, PP2A alpha and beta isoforms have a increased expression in malign tumors than in benign. In addition, for the first time, calcineurin gamma isoform (CaN Aγ) was detected in tumor ofthe nervous system. During cerebellum development, PP2A showed no significant changes in proteinexpression or in the phosphatase activity. On the other hand, PP1 shows differences, not onlyin protein expression, with an increase in expression at P13 and a posterior decrease at P20. The activity of PP1 was also modified, showing an increase that correlates with the periodwhen synapses begin to form between granule cell axons and dendritic spines of Purkinjecells. When the cerebellar mutant mouse staggerer was analyzed, in which Purkinje cells areaffected and synaptic stabilization are impaired, it was found that the protein PP1 levels donot decreased at P20, as in normal cerebellum, and that the activity no increased. On the otherhand, the phosphatase that shows the most important changes was calcineurin. Specifically,protein levels of the CaN Aα isoform increased gradually with time, in correlation with theperiod of synapses formation. In addition, calcineurin showed a raise in its activity. In thestaggerer mutant, similarily levels of this protein at P11 were observed, but after this time noincrease in expression or activity were observed. With the objective to obtain a more detailed knowledge of calcineurin function,studies using several cultures of nervous system (PC12, NT2 and primary cultures ofcerebellar granule cells) were conduced. Incubations with calcineurin inhibitors andoligonucleotide antisenses against both isoforms were performed. In all the cases, inhibitionof either the activity or the expression, in particular of the CaN Aβ isoform, produced cellapoptosis, independently of the differentiated state in which the cells are found. In thisprocess, increased Bax and decreased Bad levels were involved. In particular, in NT2 cells,the increased Bax expression was associated with an increased protein translocation tonucleus, while decreased Bad levels with a punctate staining pattern in the cytoplasm,indicating a translocation to mitochondria. Later, we study what happened with these pro-apoptotic proteins in the staggerermutant mice, that presents a very low calcineurin phosphatase activity. In this case, Badshowed no modifications, but Bax levels increased condisederably. All these results suggetthat expression or activity inhibition of calcineurin induce cells to enter in apoptosis, througha mechanism that involved, at least in part, increased in Bax levels.
Citación:
---------- APA ----------
Vilá Ortiz, Guillermo. (2002). Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3456_VilaOrtiz
---------- CHICAGO ----------
Vilá Ortiz, Guillermo. "Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2002.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3456_VilaOrtiz
Estadísticas:
Descargas totales desde :
Descargas mensuales
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3456_VilaOrtiz.pdf
