Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental

Scassa, María Elida

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental
Autor:	Scassa, María Elida
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Biología Molecular
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2002
Fecha en portada:	2002
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Químicas
Director:	Cánepa, Eduardo Tomás
Idioma:	Español
Tema:	química/química biológica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3449_Scassa
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3449_Scassa.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3449_Scassa
Ubicación:	Dep.003449
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Scassa, María Elida. (2002). Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3449_Scassa

Resumen:

La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínsecade quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y lafosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan comomoléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad deproteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidadregulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Esteevento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK,respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre laexpresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y encélulas de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de labiosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementamarcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamientocon insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAStanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosisdependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otraparte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormonalo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos unaconstrucción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALASdirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfeccionestransientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes paracaracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membranaplásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización deinsulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Losinhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que elinhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represiónhormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantesnegativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. Lacotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección conformas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibiciónhormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamientosimilar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o ala PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que laseñalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354)del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado ríoarriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta lasecuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por lainsulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formaciónde complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes enesta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada deefectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB)y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre laposibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían interveniren la respuesta.

Abstract:

Insulin plays a key role in regulating a wide range of cellular processes. The binding ofinsulin to its cell surface receptors activates their intrinsic tyrosine kinase activity leadingto receptor autophosphorylation and phosphorylation of citosolic proteins known as IRSs,which serve as adapters in intracellular signaling. IRS binds a variety of Src homology 2 (SH2) domain containing proteins, when specific tyrosines are phosphorylated, includingthe regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and the growth factorreceptor binding protein 2 (Grb2). This give rise to the activation of PI3K and Ras, andhence to the activation of serine/threonine protein kinases. We have explored the action of the peptidic hormone on 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression in rat hepatocytes and HepG2 cells. The ALAS is the first enzymein the heme biosynthetic pathway and in liver at least is rate limiting, its level is normallyvery low in hepatocytes but is greatly increased in response to the addition of certainporphyrinogenic drugs such as phenobarbital. Treatment with 5 nM insulin led to asignificant decrease of both basal and phenobarbital induced ALAS mRNA, in a dosedependent manner as measured by Northern and slot blot. Moreover ALAS mRNA halflife was not modified by the presence of the hormone, suggesting that insulin plays animportant role in regulating ALAS gene transcription. In a different approach, we fused a 876 bp fragment corresponding to the 5' flanking region of the hepatic rat ALAS gene tothe bacterial reporter gene for CAT, to determine promotor activity. CAT activity washighly impaired in HepG2 cells transiently transfected with this fusion gene (pACATplasmid) when treated with insulin as measured by CAT assay. In view of the preceding findings we undertook the present work to characterize thesignal transduction pathways involved in insulin inhibition of ALAS gene expression. Weused small cell permeant molecules that are specific inhibitors of particular proteinsinvolved in insulin signaling to asses the contribution of these effectors to the hormonalregulation. Inhibitors of PI3K (wortmannin and LY 294002 ), Ras famesylation (lovastatinand PD 152440) and MEK (PD 98059) abolished insulin inhibition, however, inhibitor ofmTOR/p70RSK (rapamycin) had no effect upon insulin action. To examine the role of the Ras/MAPK and PI3K pathways in insulin signalingrelevant to ALAS inhibition we determined the effects of dominant negative and dominantactive forms of regulatory enzymes involved in these cascades. Cotransfection of HepG2cells with dominant negative forms of SOS, Ras, Raf, MEK and MAPK interferedinhibition by insulin, while cotransfection with dominant active forms of Ras, MEK andp90RSK mimicked the hormone action per se, independently of signaling input. A similarbehaviour was observed with dominant negative versions of PI3K and PKB andmyristoilated PKB, respectively. With the present results we propose that signalingthrough the PI3K and the Ras/MAPK cascades are required for insulin inhibition of ALASgene expression. Finally, the regulation by insulin was mediated by a ll7 bp fragment (-469/—354),which confered hormonal sensitivity to the heterologous thymidine kinase promotor intransient transfection assays in HepG2 cells. EMSAs showed that multiple nuclear proteinsbind to this region at conserved HNF3 and NF1 sequences. Taken together, these results suggest that the effect of insulin is due to a complexinterplay of effectors (PI3K/PKB and Ras/MAPK/p90RSK cascade intermediaries) and oftranscription factors, and underline the contribution of HNF3 and NF1 like proteins.

Citación:

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Scassa, María Elida. (2002). Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3449_Scassa

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Scassa, María Elida. "Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2002.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3449_Scassa

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