Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales

Dus Santos, María José

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales
Título alternativo:	Expression of foot and mouth disease virus antigens in alfalfa transgenic plants : its use as experimental inmunogens
Autor:	Dus Santos, María José
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA). Instituto de Virología
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	2001
Fecha en portada:	2001
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Biológicas
Director:	Borca, Manuel V.
Director Asistente:	Carillo García, Consuelo
Idioma:	Español
Tema:	biología/ingeniería genética biología/virología biología/agrobiotecnología
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3402_DusSantos
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3402_DusSantos.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3402_DusSantos
Ubicación:	Dep.BIO 003402
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Dus Santos, María José. (2001). Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3402_DusSantos

Resumen:

El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenosrelevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantasmodificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar engrandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sinnecesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en laactualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes queexiste en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posiblesvian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre nipara los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos ensus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas deadministración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos,proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenosvacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión deestructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidasdel ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso enla producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas deelaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades devirus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsidesvacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresiónheterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de losserotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA ensistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, lasconvierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún nose ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para serutilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos ypoco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas dealfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora delas proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamentea P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en lasplantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por sutamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. Lainmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta deanticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico querepresenta la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animalesdesarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente aldesafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresarantígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivosinmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestranla factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción deantígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee estesistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantastransgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna deaplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentraciónde la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se deseautilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificaciónposterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, esaltamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos quepresentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, laidentificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno pormétodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de estetrabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un grannúmero de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentanmayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa enla expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente porcolorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígenoun péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA paragenerar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidasfueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posibledetectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaronmayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg deproteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservósus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con unavacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerposespecificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas viralescompletas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerposneutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple paradetectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conservasus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Abstract:

The use of transgenic plants as a system for expressing recombinant antigens hasalready been widely evaluated and constitutes a feasible methodology for vaccine production. Plant based vaccines would be less expensive and easier to be produced in large scale. Thesevaccines could be produced in undeveloped countries without requiring sophisticated facilities,as they are currently needed. On the other hand, the use of these vaccines would eliminate therisk of contaminating viruses present in mammalian cellular lines since the plant contaminatingviruses do not constitute an actual risk for animals or humans. Additionally,edible transgenicplants expressing antigens in their tissues could be used as oral vaccines. Up to now, mostantigens expressed in plants are peptides, unique proteins or very simple structures. Nevertheless, production of vaccine antigens in heterologous systems often require theexpression of complex antigenic structures. Foot and mouth disease virus is the causal agent of a worldwide distributed highlycontagious disease of cattle. The currently used vaccine is based in the utilization of polyvalentinactivated virus. In general, progress in the process of FMDV vaccine production are pointedtoward the development of simpler and cheaper protocols involving the use of lower amount ofvirulent viruses. An alternative to the conventional FMDV vaccines are those containingrecombinant virus empty capsids after the expression of the precursor polyprotein.In the past,it has been possible to obtain empty capsids of serotypes 0, A and C using as expressionsystems E. coli, baculovirus and vaccinia virus. Although the products resultedimmunogenically efficient, the methodologies for producing them are not suitable to be used atthe industrial level. The first objective of this thesis was the production of transgenic plants of alfalfacontaining the gene encoding for the polyprotein P1, which is the precursor of all structural FMDV proteins. The transgenic constructs used contained either just P1 nor P1 along with the 3C gene. The presence of the foreign gene in the recombinant plants was detected by PCRand their transcriptional activity analyzed by RT-PCR and Northen blot. Additionally. it waspossible to demonstrate, by electron microscopy, the presence of structures with a size andshape resembling those of the FMDV empty capsides. The immunogenicity of the obtained products was evaluated in mice. Intraperitoneallyimmunized adult mice presented a FMDVantibody response detected by its activity,in ELlSA,against a synthetic peptide representing the major immunogenic area of VP1, and againstcomplete virus particles, and in Western blot, against all the FMDV structural proteins. Additionally, these animals developed a significant neutralizing antibody response andprotection when experimentally challenged with the virulent virus. These results demonstratedthe feasibility of expressing highly complex structures in transgenic plants and its use aseffective experimental immunogens. As stated earlier, results obtained by us and other research groups demonstrated thepotential feasibility of using transgenic plants as a source of antigen for vaccine production. Nevertheless, the main problem presented by this approach resides in the relatively lowconcentration of the recombinant protein in the plant tissues, which hampers its possibleutilization at the industrial scale. Thus, the development of strategies which allow theproduction of transgenic plants expressing high levels of recombinant protein wouldsubstantially modify the expectations on the utilization of this system in the future, specially inthose cases where no further steps toward the enrichment or purification of the recombinantproduct will be needed. Due to the fact that the insertion of the transgene in the plant genome is a randomprocess, it is expected the development of individuals presenting very different expressionlevels of the recombinant protein. An interesting approach could be the identification of thoseindividuals presenting exceptionally high levels of the foreign protein. Nevertheless, theidentification of those individuals,using immunological approaches, is usually a laborious andslow process. Focusing in this particular problem, the second part of this thesis deals with thedevelopment of a methodology that allows us to evaluate a significant number of individualsand select, in an easy and quick way, those presenting the highest levels of expression of theforeign protein. The methodology is based in the expression of the gene of interest as a fusionprotein along with a reporter gene which encodes for the enzyme ß-Glucuronidase (ß-Gus),which could be quantitatively detect by a oolorimetric test. In order to evaluate thismethodology, we selected as antigen a peptide which represent the amino acid residues atposition 135 to 160 of the structural FMDV protein VP1. This peptide was expressed as afusion protein along with ß-Gus. The obtained transgenic plants were first evaluated based in their ß-Gus activity. Among those presenting the highest enzymatic activity it was possible todetect, by Western blot, the presence of the FMDV epitope. The selected plants expressed aconcentration of the recombinant protein between 0.5 to 1 mg/g of the total soluble proteinextracted for the plant tissue. The peptide 135-160 appears as conserving its nativeimmunogenic characteristic since adult mice parenterally immunized with a vaccine preparedwith the foliar extracts developed a specific FMDV antibody response detected in ELISA,against the p135-160 synthetic peptide. and complete virus particles, and against native VP1 in Western blot. Additionally,the sera of these animals showed significant neutralizing antibodiestiters and the mice resulted protected against the experimental challenge with infectious virus. These results demonstrate the feasibility of using this simple methodology to detect transgenicplants expressing high levels of recombinant peptide, which completely conserves its antigenicand immunogenic properties when expressed as a fusion protein.

Citación:

---------- APA ----------

Dus Santos, María José. (2001). Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3402_DusSantos

---------- CHICAGO ----------

Dus Santos, María José. "Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2001.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3402_DusSantos

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