Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Caracterización farmacológica y estudio de la relación estructura - Función del receptor nicotínico alfa 9 |
| Autor: | Verbitsky, Miguel |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2001 |
| Fecha en portada: | 2001 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Elgoyhen, Ana Belén |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3338_Verbitsky |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3338_Verbitsky.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3338_Verbitsky |
| Ubicación: | Dep.BIO 003338 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Verbitsky, Miguel. (2001). Caracterización farmacológica y estudio de la relación estructura - Función del receptor nicotínico alfa 9. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3338_Verbitsky |
Resumen:
En este trabajo se presenta una extensa caracterización del receptor colinérgico nicotínico α9, utilizando elsistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis. Durante la mayor parte del desarrollo delmismo se tuvo como hipótesis de trabajo que α9 sería la única subunidad integrante del receptorcolinérgico nativo de las células ciliadas externas de la cóclea y de las células tipo II del aparato vestibular. Este receptor es responsable de la inhibición de la actividad de dichas células, mediada por la inervacióncolinérgica eferente coclear y vestibular. En 2001 se identificó y clonó una nueva subunidad de receptoresnicotínicos, α1O. Esto condujo a modificar la hipótesis de trabajo, para incluir la posibilidad de un receptorheteromérico α9αl0 en las células ciliadas, pero sin excluir la posible existencia del receptor homoméricoα9 en otros tipos celulares. La caracterización del receptor homomérico recombinante α9 incluyó el estudio de las propiedadesfarmacológicas del mismo. En particular, se demostró que a pesar que α9 es un miembro de la familia degenes de subunidades de receptores nicotínicos, el receptor no puede ser clasificado farmacologicamentecomo nicotínico o muscarínico y presenta un perfil farmacológico mixto, en coincidencia con lo reportadopara el receptor nativo de las células ciliadas. Se mostró que tanto agonistas colinérgicos no específicoscomo la acetilcolina y el carbacol, agonistas nicotínicos como el metilcarbacol, la suberildicolina y el DMPP y agonistas muscarínicos como la oxotremorina - M, el metilfurtretonio y el McN-A-343 soncapaces de activar al receptor α9. También la colina, un producto de degradación y precursor en la síntesisde la acetilcolina, activó al receptor α9. Notablemente, agonistas nicotínicos clásicos como la epibatidina,la nicotina y la citisina bloquearon al receptor α9 (IC50 : 1.6±0.l, 31.5±l.0 y 43.1±3.5 µM,respectivamente). Se estudió la sensibilidad de α9 a diversos antagonistas nicotínicos. En particular lametillicaconitina, un antagonista selectivo de receptores nicotínicos neuronales sensibles a la α-bungarotoxina,inhibió las respuestas de α9 a la acetilcolina en forma competitiva (IC50 : l.l±0.2 nM),siendo este el antagonista más potente de α9 hasta ahora reportado. Se demostró también que el receptor α9es bloqueado tanto por agonistas como por antagonistas muscarínicos con el siguiente orden de potencia:atropina (IC50: l.0±0.1µM, ) ~ galamina (IC50: 1.5±0.2 µM) > pilocarpina (IC50: 76±9 µM) ~ muscarina (IC50: 84±6 µM) ~ betanecol (IC50: 105±14 µM), un rango de concentraciones comparable con las requeridas para el bloqueo producido por compuestos nicotínicos. Por otra parte, se demostró la inhibición de la respuesta a acetilcolina de los receptores α9 y α9α10 pormorfina y péptidos opioides. Estos péptidos estarían presentes en la inervación eferente a las célulasciliadas del aparato vestibular y modularían su actividad a través de su acción sobre α9αl0. Se demostró también que el receptor homomérico α9 es bloqueado por Ca++ extracelular (IC50: 100±10 µM a -70 mV), en forma dependiente del potencial de membrana. Este resultado es relevante para lafisiología de las células ciliadas. Mediante la construcción de una subunidad quimérica entre α9 y el receptor de serotonina de tipo 3A, seaportó evidencia de que el dominio aminoterminal de α9 es el determinante estructural de la interacción deα9 con agonistas y antagonistas. También se construyó una subunidad quimérica mediante el empalme deporciones de las subunidades α7 y α9. Los resultados obtenidos con las dos quimeras mencionadas, indicanque los determinantes estructurales de la particular relación corriente - potencial de α9 (relacionada con lapresencia de Ca++ extracelular), estarían confinados a la región que se extiende desde el comienzo delsegundo segmento hidrófobo, supuestamente transmembranal, hasta el extremo carboxiterminal. Seidentificó un residuo en el segmento hidrófobo M2 (Q261) involucrado en la rectificación de la corriente yen el bloqueo por el Ca++. En suma, el presente trabajo demuestra que el receptor α9 presenta una farmacología mixta nicotínica - muscarínicacoincidente con la del receptor colinérgico de las células ciliadas. Esta coincidencia incluyetambién la sensibilidad de los receptores que contienen la subunidad α9 a péptidos opioides y a cationesdivalentes. Por otro lado aporta evidencia de la importancia clave del dominio aminoterminal en determinarcaracterísticas farmacológicas de α9 y del segundo segmento hidrófobo en las propiedades del canal de losreceptores α9 y α9α10.
Abstract:
This work provides an extensive characterisation of the α9 nicotinic acetylcholine receptor, making use ofthe Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. As a working hypothesis during most of theprocess of this work, the α9 protein was thought to be the only subunit present at the native acetylcholinereceptors of cochlear outer hair cells and type II vestibular hair cells. These receptors mediate inhibition ofthe activity of these cells by cholinergic cochlear and vestibular efferent innervation. In 200l α10, a newnicotinic subunit, was identified and cloned. This led to the modification of the previous hypothesis, inorder to include the possibility of an heteromeric α9α10 receptor present in hair cells, not excluding theoccurrence of homomeric α9 receptors in other cell types. The characterisation of the homomeric recombinant α9 receptor included the study of its pharmacologicalproperties. It is demonstrated that although α9 is a member of the nicotinic receptor subunit gene family,the receptor cannot be pharmacologically classified either as nicotinic or muscarinic, since it displays amixed pharmacological profile, in coincidence with what has been reported for the hair cells nativereceptor. It is shown that the α9 receptor is activated by the non-specific cholinergic agonists acetylcholine,and carbachol, as well as by the nicotinic agonists methylcarbachol, suberyldicholine and DMPP and themuscarinic agonists oxotremorine-M, methylfurthretonium and McN-A-343. Moreover choline, both adegradation product and a precursor of the synthesis of acetylcholine activates α9. Remarkably nicotinicagonists such as epibatidine, nicotine and cytisine blocked the α9 receptor (IC50 : 1.6±0.l, 31.5±l.0 y 43.l±3.5 μM, respectively). The sensitivity of α9 to various nicotinic antagonists is reported. Methyllycaconitine, a specific antagonist for α-bungarotoxin-sensitive neuronal nicotinic receptors,inhibited α9 acetylcholine-evoked responses in a competitive manner (IC50: l.1±0.2 μM), thus being themost potent α9 antagonist identified so far. It is also demonstrated that the α9 receptor is blocked by bothmuscarinic agonists and antagonists with the following rank order of potencies: atropine (IC50: l.0±0.1 μM) ~ gallamine (IC50: 1.5±0.2 µM) > pilocarpine (IC50: 76±9 µM) ~ muscarine (IC50: 84±6 µM) ~ betanechol (IC50: 105±14 µM), a concentration range which is similar to that required for the block by nicotiniccompounds. It is also demonstrated that morphine and opioid peptides inhibit acetylcholine-evoked responses in α9 andα9αl0 receptors. These peptides are present at the efferent innervation to vestibular hair cells and wouldmodulate their activity through their action on α9αl0. It is also demonstrated that the α9 homomeric receptor is blocked by extracellular Ca++ (IC50: 100±10 µM a -70 mV) in a voltage-dependent manner, a result relevant to hair cell physiology. By means of the construction of a chimeric subunit between α9 and the type 3 serotonin receptor, evidenceis provided that the α9 aminoterminal domain is the structural determinant of the α9 interaction withagonists and antagonists. A chimeric subunit was also constructed by splicing portions of the α7 and α9subunits. Results obtained with the aforementioned chimeras, indicate that the structural determinantsunderlying the peculiar α9 current-voltage relationship, are confined within the region that extends fromthe beginning of the putative transmembrane second hydrophobic segment, to the carboxiterminus. Aresidue (Q26l) within the the hydrophobic region M2 was identified as being involved in the rectificationproperties and in the block by Ca++. In summary, the present work demonstrates that the α9 receptor displays a mixed nicotinic-muscarinicpharmacology that matches that of the cholinergic receptor of cochlear and vestibular hair cells. Thesimilarities between the native and the recombinant receptors extends to the sensitivity of the α9-containingreceptors to opioid peptides and divalent cations. Evidence indicating the key importance of the aminoterminal domain in determining the α9 receptorpharmacological characteristics and of the second hydrophobic segment in the channel properties of the α9and α9α10 receptors are also presented.
Citación:
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Verbitsky, Miguel. (2001). Caracterización farmacológica y estudio de la relación estructura - Función del receptor nicotínico alfa 9. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3338_Verbitsky
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Verbitsky, Miguel. "Caracterización farmacológica y estudio de la relación estructura - Función del receptor nicotínico alfa 9". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2001.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3338_Verbitsky
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