Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum |
| Autor: | Vazquez Rovere, Cecilia |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CNIA). Instituto de Biotecnología
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 2000 |
| Fecha en portada: | 2000 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Hopp, Horacio Esteban |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3263_VazquezRovere |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3263_VazquezRovere.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3263_VazquezRovere |
| Ubicación: | Dep.BIO 003263 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Vazquez Rovere, Cecilia. (2000). Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3263_VazquezRovere |
Resumen:
La expresión de secuencias nucleotídicas codificantes para replicasas virales enplantas transgénicas fue propuesta como un sistema eficiente para conferirresistencia contra enfermedades provocadas por virus induciendo mecanismos deprotección en la planta. Una de las primeras enfermedades para las cuales este tipode protección fue ensayado en plantas de papa, es la provocada por el virus delenrollamiento de la hoja de papa (PLRV). Sin embargo, no se describieron aúndetalles sobre el mecanismo de protección. El marco de lectura abierto 2b (ORFZb) de un aislamiento argentino de PLRV fue clonado y secuenciadoencontrándose un 94% y 97% de homología con las secuencias nucleotídicas deaislamientos de origen australiano y holandés, respectivamente. Con el fin deelucidar el mecanismo de protección contra las infecciones de PLRV, seconstruyeron tres versiones del ORF2b (no-traducible en orientación sentido,traducible en orientación sentido con el agregado del codón ATG en fase detraducción y una versión en orientación antisentido) y fueron introducidas enplantas de papa (cv Kennebec) por transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Con las plantas transgénicas resultantes se realizaronensayos de infección por injertos que mostraron que con cualquiera de lasconstrucciones fue posible obtener líneas transgénicas resistentes, sugiriendo queel mecanismo de protección es independiente de la expresión de la proteína y esmediado por el RNA. No existió correlación entre el grado de metilación o elnúmero de copias del transgén presentes en las líneas transgénicas y el nivel deprotección. Los ensayos de infección natural a campo confirmaron la obtención delíneas transgénicas resistentes. También se realizaron experimentos detransformación transitoria mediante biolística de hojas derivadas de plantastransgénicas utilizando vectores que codifican proteínas de fusión GUS::ORF2b,seguidas de la visualización del nivel de la expresión del gen reportero. Losresultados apoyan la hipótesis de protección mediada por un mecanismo desilenciamiento post-transcripcional del gen de la replicasa. Con el objetivo de obtener plantas transgénicas simultáneamente resistentes alvirus Y de la papa (PVY) y al PLRV se construyó una única construcción queexpresa la proteína de cápside del virus del mosaico de la lechuga (LMV) y el gende la replicasa de PLRV. Se obtuvieron plantas de papa (cv Kennebec)transgénicas por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens quefueron evaluadas en ensayos en condiciones controladas de invernaderodesafiándolas con áfidos virulíferos e inoculación mecánica de PVY. Se encontróque 17/27 líneas transgénicas independientes exhibieron inmunidad a PLRV, 12/27 mostraron ausencia de infección con PVY y 8/27 líneas exhibieroninmunidad a ambos virus resultando buenas candidatas para los próximos ensayosde campo. Finalmente, con el fin de obtener plantas de papa simultáneamente resistentes ainfecciones virales y fúngicas, se realizaron ensayos de co-transformaciónutilizando la construcción descripta en el párrafo anterior y el vector pZP-RIP-CHIcapaz de expresar los genes de quitinasa y rip provenientes de cebada. Algunas de las plantas transgénicas múltiples fueron ensayadas en invernaderopara determinar la resistencia a infecciones producidas por PVY y PLRV yevaluar protección a Rhizoctonia solani. Se encontró al menos una línea querevela gran resistencia a las infecciones virales y una protección aumentada a losataques de los hongos. Resulta necesaria una evaluación más exhaustiva tanto deésta como de todas las líneas seleccionadas en este trabajo, en condicionesnaturales de infección a campo considerando no sólo la resistencia sino laperformance agronómica y la preservación de la identidad del cultivar.
Abstract:
Genetically engineered expression of replicase encoding sequences has beenproposed as an efficient system to confer protection against virus diseases byeliciting protection mechanisms in the plant. Potato leaf-roll was one of the firstdiseases for which this kind of protection was engineered in potato plants. However, details of the protecting mechanism were not reported, so far. The ORF2b of an Argentinean strain of potato leafroll virus (PLRV) was cloned andsequenced finding 94% and 97% of homology with Australian and Netherlanderstrains, respectively. To elucidate the mechanism of protection against PLRVinfection, three versions of ORF2b (non-translatable sense, translatable sense withan engineered ATG and antisense) were constructed under the control of the 35S CaMV promoter and the nos terminator and introduced in potato plants (cv. Kennebec) by Agrobacteríum tumefaciens mediated transformation. Graftinginfection experiments showed that resistant transgenic plants could be obtainedwith any of the constructs, suggesting that the mechanism of protection isindependent of the expression of protein and RNA mediated. Neither DNAmethylation, nor the number of transgene copies present in the transgenic linescorrelated with protection. Field trial infection confirmed that resistant transgenicevents were obtained. Biolistic transient transformation experiments of leavesderived from transgenic plants using a gene coding for the fusion protein GUS::ORF2b, followed by scoring of the number of GUS expressing leaf spots,supported that the protection is mediated by a post-transcriptional gene silencingmechanism. Several examples of transgenic plants carrying particular sequences able toconfer protection against virus diseases were published. However, there are veryfew published cases of combined resistance and there are no published evidenceson the simultaneous protection using only one genetic construct that elicits twodifferent protection mechanisms. As it was previously described, potato plantsthat were transformed with PLRV replicase coding sequence exhibit resistanceagainst virus infection mediated by a post-transcriptional gene silencingmechanism. Likewise, the expression of the coat protein coding sequence of Lettuce Mosaic Virus (LMV) conferred heterologous protection in tobacco Xanthiagainst several strains of potato virus Y (PVY). In this work a double constructcarrying the LMV coat protein and PLRV replicase gene was constructed andintroduced in potato plants (cv. Kennebec) by Agrobacterium tumefaciensmediated transformation. Greenhouse assays challenging transgenic plants withviruliferous aphids or mechanic inoculation were conducted and seventeen (out oftwenty seven independent lines) exhibited immunity to PLRV, twelve of themshowed absence of PVY replication and eight lines exhibiting immunity to bothvirus are very promising candidates for future field trials. Significant yield losses due to fungal attack limits crop productivity and can bevery severe in local epidemic infections. To obtain multiple transgenic potatoplants simultaneously resistant to virus and fungal infections we carried out co-transformationassays using the construct described above and the pZP-RIP-CHIvector carrying barley class-II chitinase and rip genes. Some of the multipletransgenic plants were assayed in greenhouse for PVY and PLRV infectionresistance and for Rhizoctonia solani protection and we found one line thatrevealed high resistance to virus and enhanced protection against fungal attack.
Citación:
---------- APA ----------
Vazquez Rovere, Cecilia. (2000). Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3263_VazquezRovere
---------- CHICAGO ----------
Vazquez Rovere, Cecilia. "Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2000.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3263_VazquezRovere
Estadísticas:
Descargas totales desde :
Descargas mensuales
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3263_VazquezRovere.pdf
