Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | biologia; quimica |
Título: | Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con Lewisx : estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo |
Título alternativo: | Characterization of monoclonal antibody FC-2.15, active against human carcinomas and reactive with Lewisx : in vitro and ex vivo functional properties studies |
Autor: | Capurro, Mariana Isabel |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Lugar de trabajo: | Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 1999 |
Fecha en portada: | 1999 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
Departamento Docente: | Departamento de Biología |
Director: | Mordoh, José |
Idioma: | Español |
Palabras clave: | ANTICUERPO MONOCLONAL FC-2.15; LEWISx; CARCINOMAS; LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES; INMUNOTERAPIA; NEUTROPENIAMONOCLONAL ANTIBODY FC-2.15; LEWISx; CARCINOMAS; NEUTROPHILS; NEUROTROPENIA; IMMUNOTHERAPY |
Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3153_Capurro |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3153_Capurro.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3153_Capurro |
Ubicación: | BIO 003153 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Capurro, Mariana Isabel. (1999). Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con Lewisx : estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3153_Capurro |
Resumen:
Este trabajo de Tesis se ha basado en la producción de anticuerpos monoclonales (AMC) dirigidos contra las células troncales de carcinoma mamario humano. lacaracterización e identificación de los antígenos (Ag) reconocidos por los mismos y laevaluación de la posible utilidad diagnóstica y terapéutica de dichos AMCs. Para suobtención, se inmunizaron ratones Balb/c con células provenientes de un paciente conun carcinoma de mama agresivo y altamente indiferenciado, negativo para laexpresión de ER y PgR, estrategia seguida con la idea de minimizar la producción de AMCs dirigidos contra Ags asociados a la diferenciación celular. De los hibridomas obtenidos fue seleccionado el AMC FC-2.15, de isotipo IgM, el cualreacciona con la mayoría de los carcinomas mamarios humanos, independientementede su tipo histológico y grado de diferenciación, reconociendo en los mismos al 80 %de las células tumorales y al 90 % de las células proliferantes del tumor, entre las quese encuentran las células troncales. El AMC FC-2.15 reconoce otras neoplasias, comocarcinoma de colon y leucemia mieloide crónica y presenta escasa reactividad con lamayoria de los tejidos normales, siendo la principal reacción cruzada con losleucocitos polimorfonucleares (PMN). En cuanto al Ag FC-2.15, la caracterización bioquímica inicial indicó un Ag denaturaleza glicoproteica, residiendo el epitope en la parte hidrocarbonada del mismo. Posteriores experimentos demostraron que el AMC FC-2.15 reconoce específicamenteal trisacárido Lewis˟ o CD15, terminalmente expuesto. Esta conclusión está basadatanto en el reconocimiento específico del AMC FC-2.15 por diferentes estructurasconteniendo Lewis˟ como en la inhibición observada en un ELISA realizado utilizandoun AMC comercial anti-CD15 como inhibidor. Asimismo, se determinó que el AMC FC-2.15no presenta reacción cruzada con el tetrasacárido sialil Lewis˟, ni con su isómero Lewisª, así como tampoco con antígenos de grupo sanguíneo A o B La reactividad del AMC FC-2.15 en los diferentes tejidos FC-2.15 -positivos fueanalizada por Western Blot sobre extractos de membrana y caracterizadadeterminando el efecto de digestiones enzimáticas (con PNGasaF y Neuraminidasa)en la persistencia del Ag. Los resultados obtenidos revelaron que Lewis˟ puede estarformando parte tanto de N-glicoproteínas como de O-mucinas. Según el tipo celularestudiado, Lewis˟ está presente en N-glicoproteínas exclusivamente (bandas de 250, 185 y 105 kDa en muestras de PMN y leucemia), predominantemente en N-glicoproteínas (bandas de 155 y 135 kDa, acompañadas con mucinas de mayor pesomolecular, en células de carcinoma de colon T-84) o predominantemente en O-mucinas (células de carcinoma de mama MCF-7).También puede variar la cantidad delactosaminoglicanos portando sialil Lewis˟, desde la ausencia (MCF-7), pasando poruna baja proporción respecto de los Lewis˟-lactosaminoglicanos (PMN) hasta llegar aun gran predominio de los mismos en leucemias y T-84. Puede concluirse, por lo tanto, que PMN normales y diferentes células tumoralespueden expresar residuos Lewis˟ y sialil Lewis˟ en muy diferente proporción y unidos adiferentes proteínas, aunque la relevancia de Lewis˟ en condiciones normales ypatológicas tiene que ser aún establecida. En cuanto a las propiedades funcionales del AMC FC-2.15, numerosos experimentosse han realizado en esta Tesis tendientes a caracterizar la interacción del AMC FC-2.15con PMN y con MCF-7, tanto in vitro como en un sistema ex vivo de circulaciónsanguínea (SEVCS). Ensayos de aglutinación han demostrado que el AMC FC-2.15 induce la agregaciónhomotípica de PMN in vitro y forma agregados heterotípicos entre PMN y célulastumorales Lewis˟-positivas. Ensayos de liberación de [51Cr]han revelado que el AMC FC-2.15 ejerce un fuerte efecto citotóxico sobre los PMN y células MCF-7 por fijaciónde complemento humano. Posteriormente, con la idea de aproximar a las condicionesen las que el AMC FC-2.15 interacciona in vivo, el ensayo de liberación de [51Cr]fuerealizado en sangre entera en circulación en un SEVCS. Contrariamente a loesperado, el AMC FC-2.15 aglutina, pero no lisa, a los PMN mientras que la lisis de MCF-7 en dicho sistema es prácticamente normal. Estas observaciones permitieron plantear la posibilidad de que en el SEVCS los PMNserían inducidos a agregarse mas rápidamente por la suma de dos mecanismosdistintos: el AMC FC-2.15 que activa a los PMN y el flujo aplicado. En la medida quelos agregados van siendo formados, habría un impedimento estérico progresivo parael acceso de los factores del sistema de complemento a la porción Fc del AMC FC-2.15y por ende los grumos de PMN formados no serían lisados. Los experimentos realizados posteriormente validaron esta hipótesis puesto quedemostraron que el AMC FC-2.15 no lisa agregados homotípicos de PMN preformadosen ensayos in vitro por un lado y que el AMC FC-2.15 es capaz de lisar a los PMN enel SEVCS, cuando la aglutinación de los mismos se impide por pretratamiento concolchicina, por otro. La lisis de MCF-7 en el SEVCS tendría lugar de todas formas debido a su incompletaagregación con los PMN. Puede concluirse entonces que la falta de lisis de los PMN por el AMC FC-2.15 encirculación y, que por el contrario, las células tumorales Lewis˟-positivas seaneficientemente lisadas, son dos caracteristicas importantes que avalan el uso del AMC FC-2.15 en el tratamiento de tumores Lewis˟-positivos, sin riesgo de producir una lisismasiva de los PMN circulantes. Los resultados presentados indican que el AMC FC-2.15 podría ser útil en lainmunoterapia pasiva de pacientes con carcinomas Lewis˟-positivos, sin necesidad deconjugarlo con drogas ni toxinas.
Abstract:
In order to produce monoclonal antibodies (mAb)against antigens (Ags) expressed bybreast carcinoma stem cells, nude mice were immunized with tumor epithelial cellsfrom a human undifferentiated primary breast carcinoma. This strategy was followed inorder to minimize the production of mAb directed against differentiation-associated Ags. A mAb designated FC-2.15 (IgM) was selected. FC-2.15 reacts with the majority ofhuman breast primary tumors, independently of their histology and hormone receptorcontent. Moreover, FC-2.15 reacts with 80% of total breast malignant tumor cells andwith 90% of proliferanting tumor cells. It recognizes other neoplasia such us coloncarcinoma and chronic myeloid leukemia and, among the normal tissues examined,strong cross reactivity was found principally with peripheral granulocytes (PMN). Biochemical studies indicate that FC-2.15 recognizes the carbohydrate moiety ofdifferent glycoproteins. Anaysis of epitope specificity has demonstrated that FC-2.15specifically recognizes terminally exposed Lewis˟ (Lex)(CD15) trisaccharide, but notsialyl Lex, Lewisª, trifucosylated Lewis y, blood group Ags A and B, globo H andgangliosides. FC-2.15 reactivity with different FC-2.15-positive tissues was analyzed by Western blotand characterized by enzymatic digestions (PNGaseF and Neuraminidase). In PMN,myeloid leukemic cells and colon carcinoma T-84 cells, Lewis˟ was found to be almostexclusively N-linked to the protein core, whereas in breast carcinoma MCF-7 cells, Lewis˟ appears to be mostly O-linked. Treatment with Neuraminidase increaseddetection by FC-2.15 in normal PMN, myeloid leukemic cells and T-84 cells but not in MCF-7 cells. It may be concluded that normal PMN and different tumor cells may express Lex andsialyl Lex residues in quite different proportions and be bound to different proteins. Therelevance of Lex in normal and pathological conditions remains to be established. Several experiments were performed in order to characterize the interaction of FC-2.15with PMN and MCF-7 cells both in vitro and in ex vivo circulating blood (EVCB),as an approach to in vivo conditions. In vitro, the binding of Lex-epitopes by FC-2.15 induces PMN homotypic aggregation. When PMN and Lex-positive MCF-7 cells are co-incubated, FC-2.15 inducesheterotypic aggregation. In 51Cr-release assays employing human complement, FC-2.15exerts a rapid and strong cytotoxic effect against PMN. However, when the effectof FC-2.15 was tested in EVCB, no lytic activity against PMN was detected, whereas MCF-7 cells were still lysed. Blood smears demonstrated that FC-2.15 induced PMNagglutination and heterotypic aggregates when MCF-7 cells were present. A pre-treatment of PMN with colchicine impaired PMN agglutination both in vitro and in EVCB. In the latter conditions FC-2.15 lytic activity was restored, suggesting that PMNhomotypic aggregation by FC-2.15, but not lysis is dependent of microtubules integrityand that PMN agglutination hinders their lysis. Moreover, when the 51Cr-release assayswere performed following agglutination, FC-2.15-cytotoxicity was restricted to isolated PMN. It may be concluded the lack of PMN lysis by FC-2.15 in circulation is reassuring, andsince Lex-positive tumor cells are efficiently lysed. FC-2.15 could be useful to eliminatecirculating Lex-positive tumor cells.
Citación:
---------- APA ----------
Capurro, Mariana Isabel. (1999). Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con Lewisx : estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3153_Capurro
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Capurro, Mariana Isabel. "Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con Lewisx : estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3153_Capurro
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