Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | quimica |
Título: | Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos |
Título alternativo: | Diferentiation between infected and vaccinated animals with foot-and-mouth disease virus by serological methods |
Autor: | O'Donnell, Vivian K. |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA). Instituto de Virología
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 1998 |
Fecha en portada: | 1998 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
Director: | Schudel, Alejandro A. |
Idioma: | Español |
Palabras clave: | VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA; ENSAYOS INMUNOENZIMATICOS; ARN POLIMERASA; DIAGNOSTICO DIFERENCIAL ENTRE INFECTADOS Y VACUNADOS; PROTEINAS NO ESTRUCUTRALES RECOMBINANTESFOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS; ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY; RNA POLYMERASE; DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC BETWEEN INFECTED AND VACCINATED ANIMALS; RECOMBINANT NONSTRUCTURAL PROTEINS |
Tema: | biología/inmunología biología/virología
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Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3098_ODonnell |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3098_ODonnell.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3098_ODonnell |
Ubicación: | Dep.BIO 003098 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. O'Donnell, Vivian K.. (1998). Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3098_ODonnell |
Resumen:
El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es elagente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica,que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados yvacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial paraevaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con lareplicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componenteprincipal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentesserotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación,como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Esconocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bienlos niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viralen el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su bajasensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con elvirus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayosinmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para laidentificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, comoproteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Acespecíficos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz dedetectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural oexperimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros debovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinosy porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en unaespecificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %),específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animalesvacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína noestructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinosinfectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. Elestudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Accontra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para serutilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorearactividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con unao dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego dela revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajovacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D parauna mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso deproteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo yprovee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas noestructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en laidentificación de animales infectados con VFA.
Abstract:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV), an Aphtovirus of the Picomaviridae family, isthe causal agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hoovedanimals. Differentiation between infected and vaccinated animals and the detection of carriersanimals are essential to evaluate the effectiveness of control and eradication campaigns. Detection of antibodies against a non-structural antigen associated with the replication ofthe virus, the virus-infection-associated (VIA) antigen, the main component of which is theviral RNA polymerase or 3D protein, highly conserved among all serotypes, has been a usefultool in monitoring control and eradication programmes, as an indirect indicator of viral activityat the population level. It is well known that inactivated vaccines against FMDV can induce antibodies againstthe VIA antigen, although the levels of antibodies and their persistence are lower than ininfected animals. This transitory and variable response is attribuited to the presence of traces ofthe viral polymerase in the vaccine antigen, which could be antigenic and result in theproduction of antibodies against the VIA antigen. The most widely used method for measuring antibody to the VIA antigen is the Agar Gel Immunodiffusion (AGID). The method is simple to perform, but its low sensitivity and the useof partially purified antigen derived from infected cell cultures, made necesary thedevelopment of other methods. With the aim of overcome this difficulties, immunochemical assays were developed, ableto detect antibodies against FIVHDV non-structural proteins for the identification of infectedanimals with the virus. Recombinant non-structural proteins, 3D and 2C, were expressed in Escherichia coli, asfusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). A liquid-phase blocking sandwich ELISA assay (ELISA-3D) able to detect specificantibodies to the 3D protein or RNA polymerase of FMDV was developed. The ELISA-3D,was able to detect antibodies against the 3D protein in cattle sera after natural or experimentalinfection as early as 5 days postinfection (dpi) and at later stages, 565 dpi, whereas sera fromnaive cattle from the FMD free area as bovine and porcine reference sera raised againstdifferent RNA and DNA viruses were negative, resulting in a specificity of 100%. Comparisonof the ELISA-3D with the AGID and the ELISA-VIA previously described (Alonso et al., 1990), which used the semipurified VIA antigen, shows that the ELISA-3D is highly sensitive (95.2%), specific (100%) and reproducible (C.V. 2.75%). Assays in vaccinated cattle sera,demostrated a transitory antibody response induced by some vaccines. The evaluation of the “Western blot”, using as antigen the non-structural 2C protein,shows a positive reaction with sera from infected cattle, whereas sera from naive cattle from FMDV free area did not react. One of 79 sera from vaccinated cattle shows a positive antibodyreaction against 2C. The results obtained here indicate that the ELISA-3D method must be used as acomplementary method for seroepidemiological studies for monitoring viral activity. Antibodyresponse to 3D induce in vaccinated or revaccinated animals was transient. The increase in thefrequency of positive reactions after revaccination, suggest that to monitor viral activity incontrol programmes under vaccination, it is necessary to take into account the parameters ofthe post-vaccination anti-3D response, to make a better evaluation of the results obtained. Finally, the use of bioengineered proteins has advantages such as stability and purity, it doesnot require handling infective virus and provied a consistent source of antigen. The detectionof antibodies to other non-structural proteins, as 2C, provides confirmatory evidence for theidentification of FMDV infected animals.
Citación:
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O'Donnell, Vivian K.. (1998). Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3098_ODonnell
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O'Donnell, Vivian K.. "Diferenciación de animales vacunados de infectados por el virus de la fiebre aftosa por métodos serológicos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1998.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3098_ODonnell
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