Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Estructura y función en las tiorredoxinas factores que determinan su especificidad por enzimas del ciclo de fijación de CO sub 2 |
| Título alternativo: | Structure and Function in Thioredoxins : Interaction with enzymes of the CO2 fixation cycle |
| Autor: | Mora García, Santiago |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Investigaciones Bioquímicas
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 1998 |
| Fecha en portada: | 1998 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Wolosiuk, Ricardo Alejandro |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3063_MoraGarcia |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3063_MoraGarcia.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3063_MoraGarcia |
| Ubicación: | Dep.003063 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Mora García, Santiago. (1998). Estructura y función en las tiorredoxinas factores que determinan su especificidad por enzimas del ciclo de fijación de CO sub 2. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3063_MoraGarcia |
Resumen:
Las Tiorredoxinas (Trx) son proteínas citoplasmáticas halladas en todos los sistemas biológicos, quecatalizan con alta eficiencia la reducción de puentes disulfuro en otras proteínas por medio de un parde cisteínas en su centro activo. En los organismos fotosintéticos oxigénicos, la reducción mediadapor Trxs modula la actividad de numerosas enzimas de las vías asimilativas. En el estroma de loscloroplastos se encuentran dos tipos de Trxs, filogenéticamente distantes: Trx-f, de linaje eucariótico, y Trx-m, emparentada con las Trxs bacterianas. La actividad de la Fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa),una enzima clave del ciclo de fijación de CO2, es estimulada selectivamente por la Trx-f, mientras quela Trx-m resulta ineficaz. Para caracterizar los factores involucrados en la interacción entre la Trx-f y la cFBPasa, y para indagaren la relación entre estructura y función en las Trxs, se utilizó como modelo la Trx de Escherichia coli,ineficaz en la activación de la enzima, pero muy estudiada funcional y estructuralmente, y se siguióuna estrategia de mutagénesis dirigida. Un aspecto considerado fue la contribución de las cargas superficiales, ya que las interaccioneselectrostáticas son importantes para la afinidad entre proteínas. La introducción de cargas positivasalrededor del centro activo de la Trx de E.coli, sin modificar la estructura o la capacidad de reducción,aumentó considerablemente la capacidad de activar la enzima. Con altas concentraciones salinas enel medio, la afinidad de todas las Trxs por la enzima resultó similar, lo que corrobora la importancia delas interacciones electrostáticas. Las cisteínas reactivas de la cFBPasa se encuentran, de hecho, enuna zona cargada negativamente, y regiones de carga negativa rodean el centro activo de la Trx-m yde E.coli, mientras que en la Trx-f la contribución de cargas positivas es mayor. Ciertas posiciones cercanas al centro activo, de importancia estructural en las Trxs, se hanconservado estrictamente. Sin embargo. las Trx-f presentan desviaciones únicas. Se reemplazaronsucesivamente los residuos en la zona hasta alcanzar la secuencia encontrada en las Trx-f. Loscambios alteraron la conformación de un residuo triptofano conservado, y llevaron a una disminucióntanto en la estabilidad estructural de las proteínas como en la capacidad reductora, que afectó a laactivación de la enzima. La conformación de la zona inmediata al centro activo y la capacidadreductora son pues importantes para la activación de la enzima. En las Trx-f se deben dar cambiosque permitan compensar los cambios, pero el significado funcional de los mismos permanece oscuro. Se aisló la secuencla codificante para la Trx-f de colza (Brassica napus), y la proteína sesobreexpresó y purificó. Si bien son potentes activadores de la cFBPasa, las Trx-f son pobresreductoras de puentes disulfuro en otras proteínas, y tampoco muestran una mayor actividad en laisomerización estos enlaces, lo que demuestra que el componente cinético es fundamental en lainteracción con la enzima. Estos resultados sugieren que las interacciones electrostáticas y los aspectos conformacionalesjuegan un papel preponderante en la interacción entre las Trxs y (algunas de) sus proteínas sustrato, yque en los cloroplastos este factor podría determinar la especialización funcional de ambos tipos de Trx. Sin embargo, el significado fisiológico de la presencia de dos Trxs diferentes es aún esquivo.
Abstract:
Thioredoxins (Trx) are cytoplasmic proteins found in all living organisms. They efficiently catalyse thecleavage of disulfide bridges in other proteins through a pair of reactive cysteines in their active centre. In oxygenic photosynthetic organisms, Trx-mediated reduction modulates the activity of severalassimilative enzymes. Two types of phylogenetically divergent Trxs coexist in the chloroplasts' stroma: Trx-f, of eukaryotic lineage, and Trx-m, akin to prokaryotic counterparts. The activity of Fructose-1,6-bisphosphatase (cFBPase), a key enzyme in the CO2 fixation cycle, is selectively stimulated by Trx-f,whereas Trx-m is inefficient. Escherichia coli Trx barely activates the enzyme, but instead is the most thoroughly studied Trx in bothstructure and function. Taking it as a model, we set out to characterise factors involved in theinteraction between Trx-f and cFBPase, following a site-directed mutagenesis strategy. Surface charges are relevant features determining the association rate between proteins. Positivecharges introduced around the active centre of E.coli Trx did not alter its structure nor its reductivecapacity, but significantly enhanced its ability to activate the enzyme. At high salt concentrations, theaffinity of all Trxs towards cFBPase converged to a limiting value, which stresses the importance ofelectrostatic interactions. Reactive cysteines in cFBPase are in fact included in a negatively chargedregion. Also, negative charges surround the active centre of E.coli and m type Trx, whereas in Trx-fthere is a significant contribution from positive charges. In Trxs, several positions around the active site have been strictly conserved. Trx-f display howeversome peculiar deviations from consensus. Aminoacids were replaced so as to match the sequencefound in Trx-f. Changes altered the conformation of a conserved tryptophan residue, and brought abouta decrease in the structural stability of mutant proteins and in their reducing strength, damaging theactivation of cFBPase. Conformation near the active centre, as well as reducing ability, are thusimportant for the activation of the enzyme. Compensatory shifts should take place in Trx-f, but theirfunctional meaning, if any, remains obscure. Tha coding sequence of rapeseed (Brassica napus) Trx-f was determined, and the protein wasoverexpressed and purified. Though highly proficient in the activation of cFBPase, Trx-f are feeble inthe reduction or isomerisation of disulfide bridges in other proteins. These facts suggest that there is acrucial kynetic component in the interaction with the enzyme. In brief, electrostatic interactions and the conformation of the active site seem to play a central role inthe interaction between Trxs and (some of) its target proteins. This feature could be responsible for thefunctional specificity of both Trxs. Nonetheless, the physiological significance of two different Trxs inchloroplasts is still elusive.
Citación:
---------- APA ----------
Mora García, Santiago. (1998). Estructura y función en las tiorredoxinas factores que determinan su especificidad por enzimas del ciclo de fijación de CO sub 2. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3063_MoraGarcia
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Mora García, Santiago. "Estructura y función en las tiorredoxinas factores que determinan su especificidad por enzimas del ciclo de fijación de CO sub 2". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1998.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3063_MoraGarcia
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