Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana

Matrajt, Mariana Laura

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana
Autor:	Matrajt, Mariana Laura
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos G. Malbrán" (ANLIS). Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI). Departamento de Parasitología
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	1997
Fecha en portada:	1997-12
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Biológicas
Director:	Garberi, Juan C.
Director Asistente:	Angel, Sergio
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2982_Matrajt
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n2982_Matrajt.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n2982_Matrajt
Ubicación:	Dep.BIO 002982
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Matrajt, Mariana Laura. (1997). Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2982_Matrajt

Resumen:

Toxoplasma gondii es uno de los parásitos protozoarios más ampliamentedistribuidos a nivel mundial, y usualmente causa una enfermedad asintomática enlos humanos. Sin embargo, la reactivación de la infección crónica en pacientesinmunocomprometidos, y la toxoplasmosis congénita de una infección primariaadquirida durante el embarazo, presentan cuadros clínicos muy severos e inclusopuede causar la muerte del paciente. Además, debido a que T. gondii causamortalidad de los neonatos en ovejas, también representa una causa importante depérdida económica en las granjas. En este trabajo dos familias de ADN repetitivas de T. gondii fueroncaracterizadas. ABGTg7 (721 bp) presenta dos monómeros repetidos completos y 55 nt de un tercero, mostrando una disposición de tandems directos cuya unidadrepetida es de aproximadamente 340 bp. ABGTg8 (1002 bp) contiene dos elementosrepetidos distintos: uno denominado ABGTg8.2 y un elemento ABGTg7. ABGTg7y ABGTg8.2 muestran patrones de hibridación muy similares en Southern-blots de ADN de T. gondii digerido con distintas endonucleasas de restricción, sugiriendoque ambos elementos principalmente se encuentran en la misma estructurarepetitiva en tandem en el genoma. Análisis de PFGE mostraron que estos elementosrepetidos se encuentran en al menos tres de los 4 cromosomas más grandes de T.gondii. Ensayos de sensibilidad a la endonucleasa Bal 31 indicaron que seencuentran localizados cerca de los telómeros de los cromosomas así como tambiénen otras regiones de los mismos. Cinco fagos lambda recombinantes genómicosfueron aislados y dos clusters diferentes completos de la estructura repetitiva fueronanalizados. Ambos clusters contienen uno de sus extremos conservados con unfragmento de 4.4 Kbp donde se halla ubicado ABGTg8.2, ligado a numerososfragmentos Sal I conteniendo todos al menos una copia de los monómeros de ABGTg7. Dentro de estos clusters ambos elementos repetidos forman parte de unaestructura compleja en tandem, donde los monómeros de ABGTg7 se encuentrandispuestos tanto como tandems directos como flanqueados por otros elementosrepetitivos sin o con baja homología entre ellos. Esta estructura repetitiva en tandemcumple los requerimientos asignados al ADN satelital. Por otra parte, se evaluó el uso potencial de la secuencia ABGTg7 para eldiagnóstico de la toxoplasmosis humana. Se realizaron ensayos de hibridaciónmediante la técnica de Dot-blot en muestras de sangre de pacientes contoxoplasmosis cerebral (CT), linfoadenopatía toxoplásmica (ATL) y toxoplasmosisdiseminada en pacientes trasplantados (TR). Se estudió un total de 84 individuos. Seencontraron señales positivas por Dot-blot en 12 (66.7%) de 18 casos con CTconfirmada, 9 (52.9%) de 17 casos con ATL y 2 (66.7%) de 3 casos con TR contoxoplasmosis. En paralelo se realizaron ensayos de PCR en los pacientes con ATL,resultando en la detección de ADN de T. gondii en 10 casos (58.8%). Un estudiocomparativo entre el Dot-blot y la PCR fue realizado también en ratonesexperimentalmente infectados con taquizoitos, el cual arrojó resultados similares: 60% y 70% de valores positivos respectivamente. Finalmente la suma de valorespositivos obtenidos con ambos tests (Dot-blot más PCR) incrementó el número desospechas de infección toxoplásmica en los pacientes con ATL a un 76.4% de casos. Por otro lado, si se consideran los resultados positivos obtenidos simultáneamentepor las dos técnicas, se confirmó el resultado en el 35.2% de los casos. Estosresultados indican que la sonda repetitiva ABGTg7 es un recurso adicional útil parael diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudiosbásicos sobre la organización genómica de estos elementos repetidos, se desarrollóun ensayo de PCR basado en la secuencia ABGTg7 con el objeto de ser evaluadocomo herramienta diagnóstica.

Abstract:

Toxoplasma gondii is one of the most widely distributed protozoan parasitesin the world, and usually causes asymptomatic disease in humans. However,reactivation of chronic infection in immunocompromised patients, and congenitaltoxoplasmosis resulting from primary infection acquired during pregnancy, presentsevere and life threatening clinical events. In addition, since T. gondii causesneonatal mortality in sheep, it also represents a major cause of economic loss in thefarming industry. In the present work two T. gondii repetitive DNA elements werecharacterized. ABGTg7 (721 bp) exhibited two complete repeat monomers and 55 ntof a third one, showing an array of direct tandems with a repeat monomer of about 340 bp long. ABGTg8 (1,002 bp) contains two different repetitive DNA elements:one named ABGTg8.2 and an ABGTg7-like element. ABGTg7 and ABGTg8.2,displayed very similar hybridization patterns in Southern blots of T. gondii DNAdigested with different restriction endonucleases suggesting that both repeats aremainly present in the same tandem repeat structure. PFGE analysis showed thatthese repeats are present in at least three of the four largest chromosomes of T.gondii. Bal 31 sensitivity assays indicated that these elements are located near thetelomeres and along other regions too. Five genomic lambda phages were isolatedand two different completed clusters of the repeated structure were analyzed. Bothclusters have a conserved border of about 4.4 Kbp where ABGTg8.2 is situated,linked to several Sal I fragments, all containing at least one copy of an ABGTg7monomer. Inside these clusters both repeats are members of a more complex tandemstructure where ABGTg7-like monomers can be arranged either as direct tandems orflanked by other repeats which have no or low homology among them. This noveltandemly repeated structure meets the requirements assigned for satellital DNA. Besides, the potential diagnostic use of ABGTg7 is reported. A Dot-blothybridization assay in blood samples for diagnosis of cerebral toxoplasmosis (CT),acute toxoplasmic lymphadenopathy (ATL) and disseminated toxoplasmosis intransplant recipients (TR), was applied. A total of 84 individuals were studied. Wefound positive hybridization signals in 12 (66.7%) out of 18 cases of confirmed CT, 9 (52.9%) out of 17 of ATL and 2 (66.7%) out of 3 of TR. PCR assays wereperformed in parallel in patients with ATL resulting in T. gondii DNA detection oflO cases (58.8%). A comparative study between Dot-blot and PCR assays performedin blood of mice that had been experimentally infected with tachyzoites gave similarresults: 60% and 70% of positives respectively. Finally the sum of positive valuesobtained with both DNA tests (Dot-blot plus PCR) increased the number of patientswith suspected toxoplasmic infection in ATL patients, up to 76.4%. On the otherhand, positive values obtained simultaneously by both tests, allow to confirm theresults in 35.2% of the cases. These results demonstrate that T. gondii ABGTg7repetitive DNA element is an additional useful resource for diagnosing Toxoplasmaparasitemia. Finally, taking into account the genome organization basic studies of therepetitive elements, a PCR based on ABGTg7 sequence was developed in order tobe evaluated as a diagnostic tool.

Citación:

---------- APA ----------

Matrajt, Mariana Laura. (1997). Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2982_Matrajt

---------- CHICAGO ----------

Matrajt, Mariana Laura. "Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1997.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2982_Matrajt

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