Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas en invertebrados : estudio de la presencia parcial o total del camino metabólico de la manosa 6-fosfato en Chasmagnatus granulata |
| Autor: | Alvarez, Vivian Alejandra |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Luis F. Leloir" (Fundación Campomar)
|
| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 1994 |
| Fecha en portada: | 1994 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Biología |
| Director: | Couso, Roberto Oscar |
| Director Asistente: | Parodi, Armando José |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2690_Alvarez |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n2690_Alvarez.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n2690_Alvarez |
| Ubicación: | BIO 002690 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Alvarez, Vivian Alejandra. (1994). Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas en invertebrados : estudio de la presencia parcial o total del camino metabólico de la manosa 6-fosfato en Chasmagnatus granulata. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2690_Alvarez |
Resumen:
Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesishacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está el que permiteque las enzimas lisosomales recién sintetizadas alcancen su destino final dentrode la célula: los lisosomas. Las células de mamíferos utilizan para la localización de las hidrolasas ácidasprincipalmente el marcador manosa 6-P . Este sistema de transporte se basa decuatro componentes :a) un dominio proteico específico común presente entodas las enzimas lisosomales que lo utilizan ; b) la enzima clave UDP-N-acetilglucosamina:enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa) que reconoce dicho dominio y transfiere N-acetilglucosaminaa determinadas manosas sobre los oligosacáridos de altamanosa de los aceptores ; c) una N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa), que hidroliza la N-acetilglucosaminagenerando el marcador manosa 6-P ; y d) receptores demanosa 6-P que median el transporte de las hidrolasas ácidas hacia loslisosomas. Las membranas de dos eucariotas unicelulares , la Acanthamoeba castellanii y Dytiostellium discoideum tienen una actividad enzimática capaz de transferir N-acetilglucosamina 1-fosfato a partir de UDP-N-acetilglucosamina a residuos demanosa sobre oligosacáridos de alta manosa . La ausencia de la segunda enzimade este camino metabólico y de un receptor capaz de reconocer el marcadormanosa 6-P, sugiere que la GlcNAc-fosfotransferasa sirve en estos organismospara una diferente función celular. No se ha detectado en el protozoo Trypanosoma cruzi actividad de GlcNAc-fosfotransferasa,ni se han encontrado residuos de fosfato sobre losoligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales o de una enzimalisosomal purificada. En plantas y levaduras las hidrolasas ácidas están en las vacuolas, equivalentesmorfológicos y funcionales de los lisosomas de mamíferos . Las evidenciasindican que en estos sistemas la señal para la localización de las hidrolasasácidas en dichas organelas es independiente del marcador manosa 6-P y que lamisma está codificada dentro de la secuencia aminoacídica primaria de lasproteínas allí destinadas. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los invertebrados, pero hastael momento no había datos bibliográficos acerca del transporte de las enzimaslisosomales hacia esas organelas. En invertebrados se había informado de la presencia de fosfato hidrolizable porendo-N-acetilglucosaminidasa H en la vitelogenina de la larva de la mariposa deltabaco, Manduca sexta, marcada con [³²P]. También se había encontradomanosa 6-P en hidrolizados de vitelina aislada de los oocitos de la vinchucavenezolana, Rhodnius prolixus, luego de alimentar los insectos con sangreconteniendo [³²P]. Chao y Raikhel encontraron que el cDNA de una proteasaaspártica ácida (lisosomal) del mosquito Aedes aegypti tiene una secuenciahomóloga a la que en la catepsina D, enzima lisosomal de mamíferos, estáimplicada en la formación del dominio protéico para el reconocimiento por la GlcNAc-fosfotransferasa y la formación de manosa 6-P. Recientemente Guillén y colaboradores (1993) informaron por primera vez de lapresencia de una actividad de GlcNAc-fosfotransferasa, primera enzima de la víametabólica en la formación del marcador manosa 6-P, en las membranas de undíptero, la mosca mediterranea de la fruta, Ceratitis capitata La GlcNAc-fosfotransferasa de Ceratitis capitata presenta propiedadescataliticas similares a las de la enzima de mamíferos . Esta enzima transfiere N-acetilglucosamina 1-fosfato a manosas presentes en los oligosacáridos de altamanosa tanto de glicoproteínas endógenas como de la uteroferrina, una enzimalisosomal de mamíferos. Además al igual que la GlcNAc-fosfotransferasa demamíferos es capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo sonpero que poseen idénticos oligosacáridos de alta manosa La GlcNAc-fosfotransferasa de Acanthamoeba castellanii también fosforila mejorenzimas lisosomales que glicoproteínas no lisosomales, sin embargo no existeen estos organismos direccionamiento de hidrolasas ácidas a través delmarcador manosa 6-P. Por lo tanto, la existencia de la GlcNAc-fosfotransferasaespecífica en Ceratitis capitata no indicaba necesariamente que estuviera todala vía. Para estudiar la presencia del sistema de translocación de enzimas lisosomalesque utiliza el marcador manosa 6-P en invertebrados se utilizó como modeloexperimental un crustáceo, el cangrejo de estuario Chasmagnatus granulata. El hepatopáncreas de Chasmagnatus granalata se utilizó como fuente dehidrolasas ácidas. Se purificó a homogeneidad una de ellas, la α-L-fucosidasa. Sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas solubles totales y enparticular sobre los de la α-L-fucosidasa, se determinó la presencia de manosa-P. También sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales seencontró N-acetilglucosamina unida externamente a los mismos través del C1,ya que pudo ser removida por un tratamiento de hidrólisis ácida suave. En las membranas del hepatopáncreas se encontraron además actividades de GlcNAc-fosfotransferasa y GlcNAc-fosfodiesterasa, primera y segunda enzimade la vía que utiliza el marcador manosa 6-P y una posible molécula receptorapara la fosfomanosa. UDP-N-acetilglucosamina: enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa). La actividad de GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata es capazde transferir in vitro N-acetilglucosamina 1-fosfato a α-metilmanósido. Elproducto que se forma a partir de esta reacción es GlcNAc-(α1,6) P-(α 1-metilmanósido),similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas . La actividad específica de la GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatusgranalata está entre las más bajas descriptas hasta el momento. Esta enzima,al igual que la de mamíferos y la de Ceratitis capitata , fosforila mejor enzimaslisosomales que glicoproteínas no lisosomales. La GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata tiene requerimientosde pH y de catiomes similares a los informados para las enzimas de mamíferosy de Ceratitis capitata . N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa) Hasta este momento no se había descripto una actividad de GlcNAc-fosfodiesterasaen organismos distintos de los vertebrados. La GlcNAc-fosfodiesterasa de Chasmagnatus granulata es capaz de liberar [14C]GlcNAc a partir de [14C]GlcNAc-(α 1,6) P-(α 1-metilmanósido). Esta enzima,al igual que su contraparte de mamíferos es una enzima integral de membrana,y su actividad no requiere de la presencia de cationes divalentes. Receptores para manosa 6-fosfato En las membranas del hepatopáncreas se encontraron dos proteínas de pesosmoleculares aproximados de 215.000-220.000 Da y 205.000 Da capaces deunirse a una columna de afinidad preparada a partir de fosfomanano de levaduraunido a Sepharosa 4-B y eluirse especificamente con manosa 6-P. Estas proteínas fueron reconocidas por antisueros preparados contra losreceptores para manosa 6-P de 275.000-300.000 Da ( Man-6-P/IGF-II) y de 46.000 Da (CD-MPR)de mamíferos . Dichas proteínas serían las responsablesde unir los residuos de fosfomanosa presentes sobre los oligosacáridos de lashidrolasas ácidas de Chasmagnatus granulata. Por lo tanto, en este trabajo de tesis se demostró por primera vez que el caminoque usa el marcador manosa 6-P para la translocación de enzimas lisosomales,tal como se Io describió inicialmente en mamíferos, está presente también eninvertebrados.
Citación:
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Alvarez, Vivian Alejandra. (1994). Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas en invertebrados : estudio de la presencia parcial o total del camino metabólico de la manosa 6-fosfato en Chasmagnatus granulata. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2690_Alvarez
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Alvarez, Vivian Alejandra. "Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas en invertebrados : estudio de la presencia parcial o total del camino metabólico de la manosa 6-fosfato en Chasmagnatus granulata". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1994.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2690_Alvarez
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