Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Inhibidores fisiológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatideos |
| Autor: | Rilo, María Cristina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)
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| Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
| Fecha de defensa: | 1993 |
| Fecha en portada: | 1993 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química (hasta 1976) |
| Director: | Stoppani, Andrés Oscar Manuel |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2554_Rilo |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n2554_Rilo.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n2554_Rilo |
| Ubicación: | 002554 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Rilo, María Cristina. (1993). Inhibidores fisiológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatideos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2554_Rilo |
Resumen:
En el presente trabajo de tesis se realizó el estudio deinhibidores fisiológicos y farmacológicos de la H+-ATPasamitocondrial de tripanosomatídeos, con el fin de esclarecer elmecanismo de acción de la enzima de parásito, aportandomayores evidencias que permitan establecer posiblesdiferencias y similitudes con la enzima de mamífero. 1.- Se aisló y estudió el inhibidor peptidico (IF1) de la H+—ATPasdae T.cruzi y C.fasciculata. Los resultados obtenidosfueron los siguientes: a) Las partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculatafiltradas a través de una columna de Sephadex G-50, aumentaronsu actividad 3-4 veces, debido a la separación del IF1 de laenzima. El inhibidor de T.cruzi retenido en la columna de Sephadex G-50, se recuperó por aumento de la fuerza iónica delbuffer en presencia de DTT y EDTA. b) Para la obtención de IF1 de la H+—ATPasade fracciónmitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata se procedió según elsiguiente esquemade trabajo: I.- ruptura mecánica de las células con perlas de vidrio. II.- centrifugación diferencial para la obtención de fracciónmitocondrial. III.— sonicación en buffer pirofosfato para la obtención departículas submitocondriales. IV.- tratamiento con colato y precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 para la obtención de la H+-ATPasa. V.- calentamiento y precipitación alcohólica con el fin deaislar al inhibidor proteico. c) La actividad del inhibidor se puso de manifiesto cuando seincubaron particulas activadas en presencia de IFl, en unvolumen reducido para evitar la disociación y con el agregadode ATP-Mg para generar un estado conformacional transitorio dela enzima que permita la formación del complejo enzima-inhibidor. d) Los estudios de inhibición realizados determinaron laposibilidad de establecer interacciones entre la H+-ATPasa yel inhibidor de un mismo origen (interacciones homólogas),como asi también entre la enzima e inhibidor de distintosorígenes (interacciones heterólogas). Esto evidencia laexistencia de importantes analogías entre las H+-ATPasas y losinhibidores proteicos de distintas especies. e) Se observó inhibición de la fracción soluble de la enzima (F1-ATPasa) de T.cruzi indicando que no seria necesaria lapresencia de los componentes de membrana para que IF1interactúa con la subunidad catalitica. f) El inhibidor de C.fasciculata resultó ser sensible a lainactivación por tripsina, similar a lo observado para elinhibidor de higado de rata y de corazón bovino. g) Por filtración del inhibidor proteico a través de unacolumna de HPLC-C18 con gradiente de acetonitrilo, se obtuvoun pico máximoa 35% de acetonitrilo que presentó actividad deinhibidor. Dicho valor de gradiente se asemeja al de eluciónde IF1 de corazón bovino y de C.utilis. h) El peso molecular calculado para IF1 de C.fasciculata porelectroforesis en gel de poliacrilamida al 10 y 15% enpresencia de SDS fue 8000-8500 ± 1500. Dicho valor secorresponde a los publicados para IF1 de otros organismos. Los datos obtenidos demuestran que las caracteristicas delinhibidor proteico de T.cruzi y C.fasciculata son similares alas descriptas para otros inhibidores. 2) Se demostró la regulación de la cadena respiratoria y la H+-ATPasa mitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata porpoliaminas. Los resultados se describen a continuación: a) Las fracciones mitocondriales de C.fasciculata aisladas enpresencia de putrescina, espermidina y espermina presentaronmayor velocidad de consumo de oxigeno y disminución de laactividad de hidrólisis de ATP. b) En partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculatase observó inhibición de la H+-ATPasa por incubación conespermina, efecto posiblemente atribuido a la formación delcomplejo ATP-espermina, debido a que la inhibición porespermina se revierte con el aumento de la concentración de Mg2+ en el medio de reacción. c) La cinética de inhibición de la H+-ATPasade partículassubmitocondriales de T.cruzi incubadas con espermina fue detipo no competitivo. La fracción soluble Fl-ATPasa de T.cruzino presentó inhibición. La inactivación por espermina de la H+—ATPasa de particulas submitocondriales de C.fasciculata fuede tipo competitivo y mixto, observándose aumento del Km ydisminución de la Vmax. En la fracción F1-ATPasa de la enzimade C.fasciculata se observó inhibición de tipo competitivo. d) Las células de T.cruzi cultivadas en ausencia depoliaminas, presentaron una marcada activación de la enzima H+-ATPasa. Los presentes datos indican que las poliaminas intervienenen los procesos de regulación de los niveles de energiaintracelulares de los tripanosomatideos similar a lo observadopara células de mamíferos. 3) Se estudió la actividad de la H+-ATPasa de C.fasciculatay L.seymouri en presencia de drogas. Los resultados obtenidosmuestran que: a) El crecimiento de C.fasciculata y L.seymouri fue inhibidopor el agregado al medio de cultivo del nitrofurano nifurtimoxy de la naftoquinona CG 8-935. b) La actividad de la H+—ATPasade fracción mitocondrialobtenida de C.fasciculata y de L.seymouri cultivadas con elagregado de droga al medio no presentó modificación. c) La incubación de partículas submitocondriales con elnitrofurano nifurtimox y con la naftoquinona CG 8-935directamente en el medio de medida, produjo la inhibición dela actividad de la H+-ATPasa de C. fasciculata, de L.seymouri yde T.cruzi. d) La incubación de la fracción mitocondrial de C.fasciculatay de L.seymouri con el sistema generador de oxi-radicalesxantina-xantina oxidasa no produjo inhibición de la H+-ATPasaa diferencia de lo observado con T.cruzi. e) La presencia de grupos -SH en la enzima H+-ATPasa de C.fasciculata y L.seymouri se puso de manifiesto incubando lafracción mitocondrial con reactivos específicos para grupossulfhidrilos (NEM, CMB y FMA). Los resultados demostraron quelos grupos -SH de la enzima de C.fasciculata se encuentranmenos expuestos a dichos reactivos que en la enzima de L.seymouri. En ambos casos el FMA fue el inhibidor másefectivo, seguido por CMB y NEM.Estos datos concuerdan con loobservado para la enzima de T.cruzi. Los datos obtenidos sugieren sutiles diferencias entre lasenzimas de C.fasciculata y L.seymouri, mientras que dichasdiferencias se acentúan aún más al compararse con la enzima de T.cruzi.
Citación:
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Rilo, María Cristina. (1993). Inhibidores fisiológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatideos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2554_Rilo
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Rilo, María Cristina. "Inhibidores fisiológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatideos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1993.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2554_Rilo
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