Resumen:
En nuestro laboratorio se obtuvieron anticuerpos monoclonales (AcMs) contra la glicoproteína GP-2 del virus de lacoriomeningitis linfocitaria, LCM, prototipo de la familia Arenaviridae. Los AcMs 33.6 y 83.6, no neutralizantes,reaccionaron con todos los miembros de la familia en reaccionesde inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y ELISA. Un tercer ACM, 9-7.9, reaccionó con el arenavirus africano Mopeia, nopatógeno, que es indistinguible por métodos serológicos delpatógeno Lassa, pero no dio reacción con este último. El análisistopográfico realizado "a posteriori" en el laboratorio demostróque 33.8 y 83.6 definen un único antígeno, conservado en todoslos arenavirus, que se donominá GP-2A, y que el epitope definidopor 9-7.9, denominado GP-2B, se superpone parcialmente con elanterior. Los arenavirus se clasifican en dos subgrupos: arenavirus del Viejo Mundo y del Nuevo Mundo, según su distribucion geográfica ylas relaciones antigénicas que existen entre ellos. GP-2A es elprimer antígeno conservado en la glicoproteína de ambos subgruposque se describe. Los dos epitopes son importantes ya sea desde el punto devista de la evolución de esta familia viral como desde un puntode vista práctico: Como en la familia se encuentran patógenoshumanos (Junin y Machupo, agentes de la Fiebre Hemorragíca Argentina y Boliviana respectivamente, además de los mencionados LCM y Lassa), un epitope conservado como el GP-2A puedeeventualmente servir como herramienta para el diagnóstico deinfecciones con estos virus; GP-2B tiene la propiedad dediferenciar a un arenavirus patógeno de otro que no lo es, lo quelo hace un probable marcador de atenuación para los arenavirusafricanos. Ei objetivo de este trabajo fue definir, a nivel de secuenciade aminoácidos, ambos epitopes sobre GP-2. Con este fin se trabajó con péptidos sintéticos, producidossobre la base de la secuencia de aminoácidos predicha para laporción correspondiente a GP-2 de GPC, el glicopéptidointracelular de 498 residuos precursor de las glicoproteínasestructurales GP-1 y GP-2 de LCM. Se determinó la reactividad en ELISA de los AcMs con 18 péptidos correspondientes a lamencionada secuencia, y se encontró que sólo uno, que abarcabalos residuos 370-382 de GPC, reaccionaba con los tres AcMs. La secuencia dc 370-382 es 37°CNY SKFWYLEHAK^382; aminoácidos subrayados estan conservados en los arenavirus LCM, Lassa, Pichindé y Tacaribe, unicos cuya secuencia se conoce. Posteriormente se trabajó también con la secuencia 368-382,debido a que los residuos 368PY369, también están conservados. Los AcMs reaccionaron específicamente con la secuencia 370-382 en ELISA y en solución, no habiendo reacción con lassecuencias adyacentes 353-370 y 378-391. La reactividad ensolución se determinó midiendo la capacidad de la secuencia debloquear la unión a la glicoproteína de LCM (arenavirus del Viejo Mundo) en reacciones de inmunofluorescencia, ELISA de virionesintactos y "Western blot". En todos los casos hubo bloqueo totalde la unión de los AcMs a GP-2 cuando los mismos habían sidopreincubados con 370-382, mientras 353-370 y 378-391no tuvieronefecto bloqueante. La secuencia 370-382 también bloqueo la uniónde 33.6 a la glicoproteína de los virus Junín y Tacaribe, del Nuevo Mundo, confirmando 1a presencia del epitope GP-2A en estesubgrupo. Con el objeto de determinar cuáles son los límites de losepitopes GP-2A y GP-2B en la secuencia 368-382 se determinó lareactividad en ELISA y en solucion de los AcMs con los siguientespéptidos: 368PYCNYSKFWYLEHAK382 370CNYSKFWYLEHAK382 372YSKFWYLEHAK382 374KFWYLEHAK382 376WYLEHAK382 368PYCNYSKFWYL378 370CNYSKFWYL378 372YSKFWYL378 Todas las secuencias excepto 374-382 y 378-382 reaccionaroncon 33.6 y 9-7.9 en ELISA y en solución. 374-382 reaccionó con 33.6, pero el grado de reacción con 9-7.9 (medido segun el títuloen ELISA y según la capacidad de bloquear la unión del AcM a laglicoproteína) fue menor. 376-382 no reaccionó con ninguno de los AcMs. Es decir que todos los péptidos con la secuencia 372-378completa contienen residuos pertenecientes tanto a GP-2A como a GP-2B. Los aminoácidos EHAK no parecen influir directamente sobreninguno de los epitopes, cuyo grado de superposición cs muy alto,ya que sus limites no pudieron definirse. Con el objeto de analizar las bases moleculares de la faltade reactividad dc 9-7.9 con Lassa y Pichindé se trabajó con lospéptidos (a) CNYTKFWYLEHAK y (b) CNYSKYWYLEHAK, donde losresiduos subrayados corresponden a sustituciones naturales queaparecen en Pichindé y Lassa, respectivamente, en la zonaconservada de la secuencia. El péptido (a) se comportd igual que 370-382, es decir que el reemplazo Ser por Thr no tuvo efectosobre la reactividad; el péptido (b), en cambio, reaccionó con 33.6 pero no lo hizo con 9-7.9, lo que sugiere que el reemplazode Phe por Tyr, que ocurre naturalmente en Lassa, seríasuficiente para destruir el epitope en este virus. Como la sustitución correspondiente a Pichindé en la zona desuperposición de GP-2A y GP-2B no afectó la reactividad de 9-7.9,se determinó el grado de reacción de este AcM con secuencias queinvolucraban residuos ubicados fuera de la zona conservada 368-378, ya que podria ocurrir que el epitope fuera discontinuo. Las secuencias probadas fueron: Píchindé: 1) AKICNYTKFWYINDTI 2) CNYTKFWYINDTI LCM: 3) MGVCNYSKFWYLEHAK 4) CNYSKFWYLEHAK(370—382) Los titulos de 9-7.9 en ELISA fueron menores con lassecuencias de Pichindé. pero en solución sólo hubo una pequeñadiferencia con la secuencia 1), sugiriendo que los residuos 365AKI367 influyen en GP-2B. En todos los casos se hicieronsimultáneamente los ensayos con 33.6, y no hubo diferencias en lareactividad. Con el objeto de evaluar la posible utilidad de la secuencia 370-382 como reactivo de diagnóstico se ensayó su reactividad en ELISA y en solución de sueros hiperinmunes contra arenavirus del Viejo y del Nuevo Mundo, obteniéndose resultados positivos. Cuandose determinó la reactividad en ELISA del suero anti-LCMcon los péptidos con deleciones y los correspondientes asecuencias de Lassa y Pichindé, el suero hiperinmune disminuyósignificativamente el titulo con respecto al título con 368-382 y 370-382, demostrando su mayor especificidad. Cuando se realizaronlos correspondientes ensayos en solución con las secuencias de Lassa y Pichíndé, la especificidad de la reacción del anticuerpopoliclonal fue total: este "vio" en las secuencias mencionadaslas diferencias que los AcMs no "veían", probablemente debido ala presencia de anticuerpos contra otro/s epitope/s virales, porejemplo el GP-2C, definido por otros AcMs obtenidos en nuestrolaboratorio. Se realizaron ensayos con sueros de convalescientes deinfecciones con diferentes arenavirus; en estos casos lareactividad de 370-382 no fue significativa, pero si lo fue la de 368-382. Se ensuyaren 36 muestras, con resultados positivos enmás del 90% de las mismas. Con el objeto de dilucidar la función biológica de lasecuencia 370-382 se realizaron diferentes ensayos: paradeterminar si 33.6 tiene influencia en la neutralización de lainfectividad viral dependiente de complementoo en laneutralización mediada por otros AcMs. Los resultados fueronnegativos en todos los casos. Para estableccr si la secuencia está involucrada en lainmunidad celular se inmunizaron cobayos con la secuencia 370-382. Los animales desarrollaron anticuerpos contra el péptidoy contra el virus, medidos por ELISA. Los ensayos preliminares delinfoproliferación de los esplenocitos de estos cobayos indicanque probablemente la secuencia 370-382 está relacionada confenómenos de inmunidad celular. La conservación de la secuencia 368-382 en los arenavirus del Viejo y del Nuevo Mundo, así cono su innunodominancia, sugierenque puede ser un componente de importancia estructural ofuncional en el virión, y apoyan la hipótesis de que losarenavírus derivan de un ancestro común. Por otra parte, la unión de anticuerpos policlonales a lamisma le asigna una utilidad potencial como reactivo para ladetección de anticuerpos contra arenavirus.
Citación:
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Weber, Elba Laura. (1989). Naturaleza de las relaciones antígenicas entre Arenavirus del viejo y del nuevo mundo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2253_Weber
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Weber, Elba Laura. "Naturaleza de las relaciones antígenicas entre Arenavirus del viejo y del nuevo mundo". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1989.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2253_Weber
