El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii : caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas

Medrano, Silvia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii : caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas
Autor:	Medrano, Silvia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	1988
Fecha en portada:	1988
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Biológicas
Director:	Ochoa, Enrique L. M.
Idioma:	Español
Tema:	biología/biología molecular y celular
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2099_Medrano
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n2099_Medrano.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n2099_Medrano
Ubicación:	Dep.BIO 002099
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Medrano, Silvia. (1988). El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii : caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2099_Medrano

Resumen:

El objetivo del presente trabajo fue estudiar elreceptor nicotínico del órgano eléctrico de Discopyqe tschudii ysus propiedades funcionales en membranas reconstituídas. En tal sentido se comprobó la existencia de sitios quefijan α-bungarotoxina y de influjo de Rb+ estimulado porcarbamilcolina en preparaciones de membranas del órgano eléctricode D. tschudii. La respuesta fue bloqueada por curare y seinactivó por incubación previa de las membranas con el agonista (desensibilización). El material fue extraido con colato de sodio y sepurificó por cromatografía de afinidad utilizandobromoacetilcolina comoligando. La actividad específica delmaterial purificado fue, en promedio, de 4,7 nmoles deα-bungarotoxina/mg proteína. El análisis de dicho material porelectroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS dedicho material reveló la presencia de cuatro bandas de PM 41.200, 49.500, 60.000 y 66.300. El receptor purificado fue incorporado a liposomas delecitina de soja (asolectina). Las propiedades funcionales delreceptor se preservaron en las muestras reconstituldas. Esto es:capacidad de fijación de ligandos, influjo de cationes estimuladopor carbamilcolina, la desensibilización de la respuesta y lastransiciones de afinidad para agonistas que se correlacionan coneste último fenómeno. Se demostró además, como habia sido observado pormétodos electrofisiológicos en preparaciones neuromusculares y pormétodos bioquímicos en fragmentos de membranas de órganoelectrico, que el Ca2+ acelera la velocidad de inactivación (desensibilización) del receptor reconstituido en liposomas. Estas observaciones sugieren la presencia de un receptorcolinergico de tipo nicotínico en el órgano electrico de D.tschudii, con características bioquímicas y funcionales similaresal receptor de las especies del género Torpedo. Esto permiteconsiderar al órgano electrico de D. tschudii como una fuente parael estudio de este receptor. El receptor nicotínico purificado y reconstituído enlíposomas fue el sistema elegido para estudiar el mecanismo deacción de la droga amantadina. Esta droga, utilizada para eltratamiento de la enfermedad de Parkinson y para prevenir ciertasinfecciones virales, produce, ademas, un bloqueo de la transmisiónneuromuscular uniéndose al receptor nicotínico en un sitiodistinto del sitio de unión de la acetilcolina. En el presentetrabajo se confirmó que la amantadina es un bloqueante nocompetitivo del receptor nicotínico ya que no afecto la fijaciónde α-bungarotoxina en equilibrio pero si produjo un bloqueo delinflujo de cationes estimulado por carbamilcolina. A través de ladeterminación del influjo de Rb+ a membranas expuestas acarbamilcolina por distintos tiempos se observo que la amantadinaaceleró la velocidad de inactivación de la respuesta (desensibilización) inducida por el agonista. La amantadina noindujo dicho fenómeno por si misma. La aceleración de la velocidaddel proceso de desensibilización seria entónces uno de losmecanismos por los cuales la amantadina ejerce el bloqueo de latransmisión colinérgica. Otro de los objetivos del presente trabajo fue estudiarla aplicación de una nueva tecnica para la reconstitución delreceptor nicotinico y comparar el funcionamiento del receptor enliposomas preparados bajo distintas condiciones experimentales. Latécnica empleada fue la de precipitación con polietilenglicol, queha sido utilizada en la reconstitución del receptor muscarinicodel corazón y el receptor α2-adrenérgico del cerebro de mamíferos. Se observó que el receptor nicotínico se incorporó a los liposomasy que un 80 % de las moleculas se orientaron correctamente en lamembrana. La fijación en equilibrio de α-bungarotoxina reveló quese produjo una perdida de 50-55% de los sitios durante elprocedimiento de reconstitución. Los valores de la constante develocidad de fijación de α-bungarotoxina de segundo orden (kt) yde la constante de baja afinidad para carbamilcolina (K1) fueroncomparables a los observados para el receptor reconstituido por elmétodo de diálisis. Sin embargo, el receptor reconstituldo por elmétodo de precipitación con PEG exhibió un minimo inílujo de Rb+estimulado por carbamilcolina y no manifestó transiciones deafinidad. Cuando la preparación de PEG se purificó, mediante elempleo de éter etílico, para eliminar las impurezas presentes enlas muestras comerciales de PEG, el receptor reconstituido exhibiótransiciones de afinidad e influjo de cationes estimulado porcarbamilcolina. El análisis de los lípidos presentes en lasmuestras reconstituldas reveló que los proteoliposomas preparadospor precipitación con PEG presentaron un contenido mayor de ácidosgrasos libres que los preparados por el método de diálisis. Losresultados sugieren que los efectos observados pueden deberse aalguna de las impurezas presentes en las preparaciones de PES y/oa la presencia de ácidos grasos libres provenientes,probablemente, de la hidrólisis de la asolectina. Con el objeto de profundizar en el estudio del fenómenode la desensibilización del receptor nicotínico, se estudió elefecto de un pentapeptido, denominado timopentina, sobre laspropiedades funcionales del receptor nicotínico reconstituído enliposomas. Se piensa que dicho pentapeptido corresponde al sitioactivo de la hormonatimica timopoyetina. La timopoyetina y latímopentinas ademas de sus efectos inmunológicos, producen unbloqueo de la transmisión neuromuscular. En el presente trabajo semuestra que la timopentina no modificó la fijación en equilibriode α-bungarotoxina pero produjo un bloqueo de la respuesta delreceptor en un rango de 10-10M a 10-4M. Más aún se observó que latimopentina aumento la velocidad de desensibilización del receptory que dicho fenómeno se incrementó en presencia de Ca2+. Estasobservaciones corroboran el efecto que sobre la transmisiónneuromuscular tiene la timopoyetina y sugieren que la timopentinao péptidos relacionados podrian modular dicha transmision.

Citación:

---------- APA ----------

Medrano, Silvia. (1988). El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii : caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2099_Medrano

---------- CHICAGO ----------

Medrano, Silvia. "El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii : caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1988.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2099_Medrano

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