Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Hidratos de carbono en Trypanosoma Cruzi : Estructura de un lipopéptidofosfoglicano |
| Autor: | Casal de Russo, Olga Liliana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2017-11-06 |
| Fecha de defensa: | 1987 |
| Fecha en portada: | 1987 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Muchnik de Lederkremer, Rosa María |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2079_CasaldeRusso |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n2079_CasaldeRusso.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n2079_CasaldeRusso |
| Ubicación: | Dep.002079 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Casal de Russo, Olga Liliana. (1987). Hidratos de carbono en Trypanosoma Cruzi : Estructura de un lipopéptidofosfoglicano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2079_CasaldeRusso |
Resumen:
El presente trabajo de Tesis tuvo por objeto ladeterminación de la estructura del lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de células epimastigote de Trypanosoma cruzi (cepa Y),agente causante de la enfermedad de Chagas. El LPPB es un componente mayoritario de la membranade la forma epimastigote, y su rol en el ciclo de vida delparásito no es aún conocido. Se Presentan: 1) Una introducción referida a la enfermedad de Chagas. Se reseñan las características del parásito, larespuesta inmunológica del organismo frente a la infecciónaguda y crónica, y los modelos experimentales. 2) Un resumen de los distintos estudios químicosrealizados sobre la superficie celular del parásito. 3) Los estudios realizados sobre estructura y distribuciónde glicofosfoceramidas. 4) Un resumen acerca de la importancia de la unión carbono-fósforocomo estructura de moléculas complejas, la biosíntesis de ácidos aminofosfónicos, y su identificación por métodos espectroscópicos. 5) Un resumen de los resultados previos sobre el LPPG. 6) La interpretación y discusión de los resultados obtenidos, que incluye: a) Purificacidn y antecedentes del LPPG. Lederkremer y col. [146] aislaron por extracción de célulasepimastigote de Trypanosoma cruzi con fenol 44%, un complejode glicoconjugados que se precipitaba con etanol de la faseacuosa. Este complejo estaba compuesto por cuatro bandas (A, B, C y D o LPPG), que se coloreaban con PAS, y se purificabana través de una columna de Bio Gel P-150. En esas condicionesel LPPG quedaba impurificado con el componente C y se extraíaselectivamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). En este trabajo de Tesis, se obvió la purificación a travésde columna, y se extrajo el complejo de glicoconjugadosprimero con cloroformo:metanol (2:1) para eliminar lipidoscontaminantes, luego directamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). El LPPG se solubiliza en esta mezcla y se precipita por agregado de metanol. Para comprobar la pureza de este producto se lo cromatografió através de Bio Gel P-150 usando buffer fosfato de sodio 0,1 M (pH=7,2) en presencia de SDS 0,1%, y se obtuvo un único pico. Se había descripto la presencia de un 60% de azúcares en el LPPG, compuestos por manosa, galactosa y glucosa (35:22:1), 1% de glucosamina, 2,1% de fosfato, 12,6% de ácidos grasos ligados como amida y como ester, y 9,5% de péptido. Con estos datos se comenzó el estudio de la estructura del LPPG. b) Estudio de la composición de bases de cadena larga. El hecho de que el ácido lignocérico, que se encuentra ligado como amida en el LPPG, sea un componente común de unidades ceramida; y que un extracto clorofórmico de un hidrolizado ácido total tuviese compuestos ninhidrina positivos [146] llevó a iniciar el análisis de las bases esfingosínicas en la macromolécula. Las bases se cuantificaron luego de hidrólisis alcalina a 100°C y se determinó que en el LPPG había 14,2 mmol% de bases. Al analizar la composición por CGL y CGL-EM se determinó la presencia de 17-metilesfinganina y esfinganina en relación 3:1. Se observo una variación en la composición de bases al analizar otras muestras del LPPG; se identificaron esfingosina y esfinganina. Esta microheterogeneidad en la molécula se encontró también en el LPG de Acanthamoeba castellanii [170]. c) Estudios comparativos realizados en cepa Tulahuen. Los estudios se realizaron para determinar la influencia del medio de cultivo en la composición de bases. Se utilizó una cepa de colección (Tul 0), y se aislaron los complejos de glicoconjugados con fenol 44%, a partir de células epimastigote cultivadas en medio Lit, Boné y bifásico. En todos los casos se encontró 17-metil-esfinganina, esfinganina y esfingosina en una relación aproximada de 88:9:2. Se compararon además los complejos de glicoconjugados de dos líneas de la cepa Tulahuén, una no virulenta (Tul 0), y otra que mantenía su infectividad (Tul 2). En Tul 2 se encontró 17-metilesfinganina como componente minoritario, y esfinganina como mayoritario, en relación 3:17 aproximadamente. Se concluyó que las bases esfingosínicas variarían en las distintas líneas de una misma cepa, y dicha variación no sería dependiente del medio de cultivo. d) Análisis de la ceramida. La ceramida se liberó por hidrólisis alcalina (NaOH 1 N, 2 h, 100°C) y se analizó por RMN H-1. Se observó el doblete a δ=1.1 con J=7 Hz, característico de un grupo isopropilo, lo cual confirmó la presencia de 17-metilesfinganina. Por la proporción de ceramida aislada, se pudo calcular un peso molecular aproximado de 6500 para el LPPG, considerando un mol de ceramida por mol de LPPG. Si se toma el dato cuantitativo de las bases el peso molecular sería de 7100. La ceramida se pudo separar por tratamiento con fosfolipasa C, por lo tanto se deduce que la porción lipídica se encuentra ligada a través de fosfato a la porción hidrofílica. Se determinó además que el hidroxilo de C-3 de la base esfingosínica en la ceramida se encuentra esterificado por ácido palmítico, mayoritariamente. e) Determinación de la presencia de inositol. Se cuantificó el inositol presente en la molécula por CGL y se encontraron 13,8 mmol%. Además se pudo separar un producto de hidrólisis ácida parcial, que al ser rehidrolizado liberaba inositol y glucosamina. f) Caracterización de las distintas uniones de fósforo en el LPPG, lo cual incluye el espectro de RMN P-31. La presencia de fosfato monoéster no se detectó por tratamiento con fosfatasa alcalina del LPPG original. Sin embargo, condiciones alcalinas suaves determinan la ruptura de ciertas uniones fosfodiéster, con la consiguiente formación de monoéster. El tratamiento con ácido dilupido también dio como resultado la formación de fosfato monoéster, que se liberaba por tratamiento con fosfatasa alcalina. El espectro de RMN P-31 a pH=10,5 mostraba un pico principal a δ=+0.67 correspondiente al fosfato diéster y dos señales a δ=+5.29 y +4.83, que se pueden asignar a pirofosfato, comparando con datos de literatura. Las señales de fosfato monoéster aparecen debido al medio alcalino, y podría tratarse de fosfato de serina. Una faceta interesante del espectro fueron las señales a campos bajos, δ=-25.06 y -21.00, características de la unión C-P, las cuales se asignaron como ácido 2-aminoetilfosfónico y ácido 2-amino-3-fosfonopropiónico. En el espectro a pH neutro se observaba una señal ancha y compleja para fosfodiéster centrada a -0.75 ppm, y la señal para unión C-P a -22.08 ppm. g) Estudio de los aminoácidos y ácidos aminofosfónicos en el LPPG. Cuando se trató el LPPG en medio alcalino suave, se observó la liberación de compuestos ninhidrina positivos. Se liberaba el 50% de los aminoácidos, principalmente glicina, serina, treonina, ácido aspártico, que se encontrarían ligados como éster en el LPPG. Se encontró también fosfato de serina, y un aminoácido con tiempo de retención igual al de hidroxilina. Sin embargo, no todos los aminoácidos del LPPG se liberan en esas condiciones, por lo tanto habría una estructura peptídica en la molécula. Se caracterizaron ácido aminofosfonopropiónico como componente mayoritario, y ácido aminoetilfosfónico como minoritario. Por electroforesis en papel, y análisis automático de aminoácidos, además del RMN P-31. La presencia de aminoácidos ligados como éster fue descripta para ácidos teicoicos donde la D-alaina se encuentra esterificando un poliol o un azúcar [246]. h) Caracterización de galactosa furanósica en el LPPG. La hidrólisis ácida parcial del LPPG dio como resultado la liberación diferencial de galactosa con respecto a la manosa. Por oxidación controlada con periodato de la macromolécula, se determinó que esa hexosa se encuentra mayoritariamente en configuración furanósica, y con los hidroxilos de C-5 y C-6 libres. Se caracterizó el azúcar obtenido por oxidación y reducción con NaBH4 del LPPG, como arabinosa. Utilizando NaB3H4 se desarrolló un método para marcar LPPG en forma exógena. i) Identificación de ribosa como constituyente de la macromolécula. La ribosa se caracterizó como azúcar constituyente del LPPG, cuando se sometió a hidrólisis ácida parcial una cantidad apreciable de LPPG. Se descartó la hipótesis de que la ribosa pudiese provenir de contaminación con ácidos nucleicos, pues en esas condiciones se hubiera liberado ribosa-fosfato. La cuantificación luego de una hidrólisis total dió una relación de ribosa, manosa, galactosa y glucosa de 1:14:7:3. Estas proporciones no eran constantes en el análisis de distintas muestras, aunque la manosa, seguida de galactosa, eran siempre los azúcares mayoritarios. j) Determinación de azúcares ligados por fosfato glicosídico. Cuando una muestra de LPPG se sometió a hidrólisis ácida muy suave, se liberó un disacárido sustituído que revelaba con reactivos de ninhidrina y fosfato. Al ser rehidrolizado en condiciones alcalinas, se separaban dos fracciones por cromatografía en una resina catiónica. El análisis por CLAR y CGL indicó que la fracción neutra estaba compuesta por una manobiosa. La fracción ácida contenia diversos componentes ninhidrina positivos; uno de ellos coincidente con el ácido aminofosfonopropiónico, detectados por electroforesis. Por lo tanto la manobiosa se encuentra ligada a la cadena a traves de fosfato glicosídico y sustituída por el ácido fosfónico. k) Estudios de metilación de la cadena de hidratos de carbono. Los resultados de los estudios de metilación del LPPG indican que la galactosa se encuentra presente fundamentalmente en la configuración furanósica, como extremo terminal no reductor. En efecto, no se detectó el 2,3,5,6-tetra-O-metilgalactitol en los estudios Consulte el resumen completo en el documento.
Abstract:
The object of this Thesis was to determine thestructure of the lipopeptidephosphoglycan (LPPG) fromepimastigote cells of Trypanosoma cruzi (Y Strain), agent ofthe Chagas' disease. The LPPG is a major constituent of the plasmaticmembrane of epimastigotes, but its role in the parasite'slife is yet unknown. This Thesis consists of: 1.- An introduction referring to the Chagas' disease; characteristics of the parasite, immunological response to the agent and chronic infection, and experimental models are summarized. 2.- A brief review on the different chemical studies on the cell surface of the parasite. 3.- Studies on the structure and distribution ofglycophosphoceramides, compared with glycoconjugates. 4.- A summary on the importance of thecarbon-phosphorus band as a constituent of complex molecules;the biosynthesis of aminophosphonic acids and itsidentification using spectroscopic methods. 5.- A summary of the previous results on the LPPG. 6.- Results and discussion, that includes: a) Isolation and purification of the LPPG. Lederkremer et al. [146] reported the extration of a glycoconjugate omplex from epimastigote cells of Trypanosoma cruzi with phenol 44%. This complex was precipitated with ethanol from the aqueous solution; and was separated into four carbohydrate-protein bands by analitical polyacrilamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulphate (SDS) (A, B, C and D or LPPG). The four components were separated using Bio Gel P-150. In these conditions the LPPg was isolated together with C, and was selectively extracted with chloroform:methanol:water (10:10:3). In this Thesis, the glycoconjugate complex was extracted with chloroform:methanol (2:1) to eliminate lipids, and then with chloroform:methanol:water (10:10:3). The LPPG dissolved in this mixture and precipitated with methanol. It was then filtered through Bio Gel P-150 equilibrated with sodium phosphate buffer 0,1 M pH=7,2 with 0,1$ SDS, and a single carbohydrate and protein peak was eluted. The composition of the LPPG has been previously described [146]. It contained 60% sugar (mannose:galactose:glucose 35:22:1); 1% glucosamine; 2,1% phosphate; 12,6% fatty acids (as esther and amine); and 9,5% peptide. b) Composition of long chain bases. The presence of lignoceric acid bounded as amide in the LPPG, together with the presence of ninhydrine positive compounds in a chloroform extract of a total acid hydrolisate, suggested the occurrence of a ceramide moiety in the molecule. The bases were quantified after alkaline hydrolisis at 100°C, and it was determined that there were 14,2 mmol% in the LPPG. They were analysed by GLC and GLC-MS, and 17-methylsphinganine and sphinganine were identifies, in a 3:1 ratio. When different samples were analised, there was a variation in the composition of the bases, and sphingosine was found instead of 17-methylsphinganine, although sphinganine was always present. This microheterogeinity in the molecule was also observed in the LPG isolated from Acanthamoeba castellanii [170]. c) Comparative studies in Tulahuen strain. The object of this experiment was to determine the influence of the culture media in the long chain bases composition. A collection strain (Tul 0) was cultured in three different media: Lit, Bone and biphasic. The glycoconjugate complex was extracted in each case with phenol 44%. In all cases, the bases found were 17-methylsphinganine, sphinganine and sphingosine (ratio: 88:9:2). The glycoconjugates isolated from two lines of Tulahuen strain, one not virulent (Tul 0), and the other maintaining its infectivity (Tul 2), were compared. The bases found in Tul 2 were 17-methylsphinganine and sphinganine (ratio: 3:17). It was concluded that the variation in the composition of bases, in different lines of the same strain, did not depend of the culture media. d) Analysis of the ceramide unit. The ceramide was hydrolised with alkali (NaOH 1 N, 2 h, 100°C) and it was studied by H-1 NMR. The characteristic duplet at δ=1.1 J=7 Hz of an isopropyl group was assigned. This confirmed the non-linear structure of the long chain base. From the amount of ceramide released, an aproximate MW of 6500 was calculated, considering 1 mol of ceramide per mol of LPPG. If the total amount of long chain bases is considered, the MW would be 7100. The ceramide was released by enzimic treatment with phospholipase C, which would mean that the lipidic unit could be linked through phosphate to the hydrophilic portion. It was also determined that the C-3 hydroxyl of the base is sterified with palmytic acid. e) Detection and quantification of inositol. The amount of inositol present in the LPPG (13,8 mmol%) was determined by GLC; even more, a product of partial hydrolisis was isolated, which, on rehydrolisis rendered inositol and glucosamine. f) Characterization of the different phosphate bonds; including P-31 NMR. Monoesther phospate was not detected in the original LPPG by alkaline phosphatase treatment. Nevertheless, mild alkaline conditions determined the cleavage of certain phosphodiesther bonds, and the subsequent appearance of monoesther. Mild acid hydrolisis also determined the appearance of monoesther phosphate, which was hydrolised with alkaline phosphatase. The P-31 NMR spectrum at pH=10,5 showed an important signal at δ=0.67 ppm which corresponded to phosphodiesther, two signals at δ=+5.29 and 4.83 which could correspond to pyrophosphate. The monoesther signals, which appeared due to the alkaline conditions and could correspond to serine phospate. An interesting feature of the spectrum were the signals at low field (δ=-25.06 and -21.00) characteristic of the C-P bond. They were assigned to 2-aminoethylphosphonic acid and 2-amino-3-phosphonopropionic acid. The P-31 NMR spectrum at neutral pH had a broad and complex signal corresponding to phosphodiesther at δ=-0.75 ppm, and the C-P bond signal at δ=-22.08 ppm. g) Aminoacids and aminophosphonic acids in the LPPG. When the LPPG was hydrolised under mild alkaline conditions, some ninhydrine positive compounds were released. Half of the aminoacids were liberated, being the most important glycine, serine, threonine, aspartic acid. They are all linked as esthers in the LPPG. Serine phosphate was also found, and an unidentified aminoacid with the same retention time of hydroxylysine was detected. Not all the aminoacids were released in this conditions, so a peptidic structure cannot be excluded in the molecule. Aminophosphonopropionic acid was characterised as the principal phosphonic acid, although aminoethylphosphonic acid was also present. Aminoacids linked as esthers have been described in teichoic acids, where D-alanine sterifies a carbohydrate or a poliol [246]. h) Caracterization of furanoic galactose. Partial acid hydrolisis of the LPPG resulted in a differential release of galactose and mannose. By mild periodate oxidation of the LPPG, it was determined that galactose is present principally in a furanoic configuration, with hydroxils of C-5 and C-6 free. The resulting sugar was characterised as arabinose. A new method using NaBH was developed to obtain radioactive LPPG. i) Identification of ribose. Ribose was characterised as a constituent of the LPPG, after a partial acid hydrolisis of a great amount of LPPG. The quantification of the neutral sugars gave ribose:mannose:galactose:glucose in a ratio 1:14:7:3. These relations were not constant, when different samples were analised. The hypothesis that ribose could come from nucleic acid contamination was discarded because that conditions could only form ribose-phosphate. j) Analysis of the glycosidically linked sugar through phosphate in the LPPG. When a Sample of LPPG was hydrolised under very mild acid conditions, a substituted disaccharide was released. When it was rehydrolised, two fractions were separated with a cathionic resin. The analysis of the neutral fraction by GLC and HRLC determined that the disaccharide was a mannobiose. The acidic fraction had several ninhydrine positive componentes, separated by paper electrophoresis, one of them coincident with aminophosphonopropionic acid. So, the manniobiose is glycosidically linked through phosphate and substituted by the aminophosphonopropionic acid. k) Methylation studies on the carbohydrate moiety. Methylation studies on the LPPG demonstrated that the galactose is principally present in the furanoic configuration, as a terminal, non-reductive end. Moreover, the 2,3,5,6-tetra-O-methylgalactitol was not detected in the degraded LPPG, as well as the 4,6-di-O-methylmannitol, which was not found in the hydrolised molecule. This would explain a branch on the C-3 of the (1→2) linked mannose. The fact that in the degraded LPPG, the 2,4,6-tri-O-methylmannitol is not found, would mean that the (1→3) mannopiranose units are part of an external chain. It would correspond to the glycosidically linked mannobiose through phosphate, and substituted by the aminophosphonic acid. Mannose linked (1→2) and (1→6) were found in the original and the degraded LPPG. l) Analysis of the C-13 NMR spectrum of the LPPG. This spectrum was similar to those of lipopolisaccharides [270]. Characteristic resonances of sugar anomeric carbons were found between 99 and 106 ppm. The signal at 105.8 was assigned to β-D-galactofuranose. Anomeric carbons of mannose appeared as a complex signal between 101.2 and 102.9, which reflects the various linkages in which this hexose is found, (1→2), (1→6) and (1→3). Partial structures of different fragments of the LPPG were postulated with the results achieve Consulte el resumen completo en el documento.
Citación:
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Casal de Russo, Olga Liliana. (1987). Hidratos de carbono en Trypanosoma Cruzi : Estructura de un lipopéptidofosfoglicano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2079_CasaldeRusso
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Casal de Russo, Olga Liliana. "Hidratos de carbono en Trypanosoma Cruzi : Estructura de un lipopéptidofosfoglicano". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1987.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2079_CasaldeRusso
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