Resumen:
Se determinaron las condiciones más apropiadas para medir la actividad de la PBGasade callos de semillas de soya, así como las mejores condiciones de extracción. Se midió actividad máxima en anaerobiosis y buffer de fosfatos, cuando se trabajó con callos crecidos en semi-aerobiosis y expuestos a la luz, y extrayendo con buffer Tris 0.1 M pH 7.4. Empleando procedimientos comunes de purificación se obtuvieron preparaciones de PBGasa purificada 76 veces, deaminasa purificada 192 veces e isomerasa, libre de deaminasa. Se encontró que 7.2 era el pH óptimo para formación de porfirinas por acción de la PBGasa o deaminasa, mientras que para el consumo de PBG se obtuvo además, un segundo máximo a pH 6.7. La formación de uroporfirinógenos en función del tiempo ocurrió luego de un "lag" de 3 —4 horas, sin embargo, para el consumo de PBG, no hubo evidencias de "lag"; además, el rendimiento de porfirinas en base al consumo de PBG, fue muy bajo. Estos datos sugirieron la formación de un intermediario en la conversión enzimática del PBG en uroporfirinógenos. La PBGasa se separó en sus componentes deaminasa e isomerasa por electroforesis sobre gel de almidón. Se determinó un peso molecular de 22,000 ± 27200 para la PBGasa, 40,0004± 4,000 para la deaminasa y 210,000 ± 21,000 para la isomerasa, aunque se obtuvieron valores de 6,000: 12,000 y 24,000 para la isomerasa, empleando columnas de Sepharosa 6B; estos datos sugerian que tanto la isomerasa como la deaminasa estarían formadas por varias unidades. La PBGasa de callos de soya es estable a -15°C,pero por calentamiento a 70°C se inactiva la isomerasa, la adición de NH; ó PBG protegieron contra la inactivación por calor, sugiriéndose que la isomerasa, por medio de un grupo negativamente cargado, se uniría al grupo amino metilo del PBG(o del intermediario polioirrólico); el PBG ó el NH;se unirian a la enzima en el mismo sitio activo y la estabilizarian. Se sugirió,la posible existencia de un cofactor unido débilmente a la enzima. Se postuló la existencia de grupos mono-y di-tiol esenciales para la actividad enzimática, además, de la existencia sobre la deaminasa de grupos cargados positivamente. Se probó el efecto de varios cationes sobre las actividades de deaminasa y PBGasa, sugiriéndose una posible asociación-disociación de las enzimas. Se encontró que las curvas de saturación de la PBGasa y la deaminasa de callos de soya son pocos comunes; los gráficos de las dobles recíprocas fueron bimodales. Se obtuvieron valores de Km1 = 6,5x10⌃–6 M y Km2 = 5.0 x 10⌃-4 M para la PBGasa, y Km1= 3.2 x 10⌃-5 M y Km2= 1.9 x 10⌃-4 M para la deaminasa, cuando se midió formación de uroporfirinógenos: los resultados fueron similares cuando se midió consumo de PBG. Se estudió el efecto del ión NH4+ sobre la forma de las curvas de saturación, y se encontró que era un inhibidor competitivo de la PBGasa. Se sugirió que el sistema enzimático contiene, al menos, dos sitios activos que interactúan. Se postuló que el comportamiento cinético observado se debe a la existencia de fenómeno de cooperatividad negativa para las enzimas de callos de semillas de soya. Se estudió la variación de la actividad de la PBGasa y del contenido de clorofila en función del tiempo de iluminación y se postuló un rol directo de la PBGasa en la síntesis de clorofila. Se estudió el efecto del agregado de diferentes sustancias al medio de cultivo, sobre el contenido de clorofila, la acumulación de porfirinas, la actividad de la PBGasa, el crecimiento. El agregado de etionina, ALA o la deficiencia de hierro, provocaron acumulación de porfirinas y activación de PBGasa. En presencia de ATP no se detectó actividad de PBGasa, el agregado de giberélico al medio de cultivo, produjo un aumento en la actividad de la PBGasa y en el contenido de clorofila, pero no se detectó acumulación de porfirinas. Se preparó PBGasa de eritrocitos de aves purificada 4910 veces; deaminasa purificada 8550 veces e isomerasa libre de deaminasa, empleando los procedimientos comunes de purificación. Se encontró un pH óptimo de 7.4 para las enzimas de eritrocitos de aves; la formación de porfirinas y el consumo de PBG, aumentó linealmente con el tiempo hasta por lo menos 6 horas de incubación y la actividad de PBGasa y deaminasa fue la misma en presencia o ausencia de oxígeno, a diferencia de las enzimas de callos de soya. La PBGasa de eritrocitos de pollos se separó en sus componentes por electroforesis de gel de almidón: se observó un comportamiento algo diferente al de las enzimas provenientes de otras fuentes. Se determinó un peso molecular de 110,000 ± 11,000 para la PBGasa: 40,000 ± 4,000 para la deaminasa y 280,000 ± 28,000 para la isomerasa postulandose una posible asociación de unidades de PM70,000 para esta última enzima. La PBGasa y la deaminasa de eritrocitos de pollos precipitadas con sulfato de amonio, mantuvieron su actividad durante varios meses a -l5°C. Por calentamiento de la PBGasa, se destruyó la isomerasa, pero aumentó significativamente la cantidad total de uroporfirinas formadas; al igual que para la enzima de callos de soya, el NH4+ y el PBG protegieron de la inactivación por calor. Se postuló la existencia de grupos mono- y di-tiol esenciales; se sugirió una competencia entre las enzimas y diferentes bases por sus sustratos; así como la existencia de grupos cargados positivamente sobre la deaminasa. Se estudió además, el efecto de diferentes cationes sobre la actividad enzimática, sugiriéndose nuevamente la existencia de grupos tiol esenciales y de fenómenos de asociación-disociación de las enzimas. Se estudió la cinética de la PBGasa y deaminasa de eritrocitos de aves, en presencia y ausencia de diferentes sales. Para la deaminasa se obtuvo un comportamiento cinético michaeliano cuando la velocidad de reacción se midió como formación de uroporfirina I, como cuando se midió el consumo de PBG. Se encontró un valor de Km= 0.9 x 10⌃5 M y n = 1,en presencia o ausencia de iones; tanto el NH4+ como el Na+ y Mg++, se comportaron como inhibidores no competitivos de la deaminasa. En ausencia de iones,los gráficos de uroporfirinógenos formados, en función de la concentración de PBG,para la PBGasa, fueron sigmoideos, resultando Km = 28 μM y n cercano a 2. En presencia de concentraciones de NH: mayores que 0.1 M, o bien de Na+ y Mg++,se obtuvo comportamiento michaeliano, y el n resultó entonces igual a 1. Los iones NH4+ resultaron inhibidores de tipo "uncompetitive" para la PBGasa de eritrocitos de aves. Cuando se midió el consumo de PBG se obtuvo un comportamiento Cinético intermedio entre michaeliano y sigmoideo y n = 1. Debido a la alta actividad y estabilidad de la PBGasa de eritrocitos de pollos, se desarrolló un método para la obtención de uroporfirina III en cantidades apreciables y con alto rendimiento. Las propiedades de la uroporfirina III obtenida por este método, coincidieron con las de este compuesto obtenido de otras fuentes. El tejido de callos de soya empleado en este trabajo es el único hasta ahora estudiado con el cual se ha observado un pronunciado "lag" en la formación de uroporfirinógenos; esto permitió detectar un nuevo intermediario polipirrólico, formado por acción de la PBGasa sobre el PBG; por acción de la deaminasa sobre el mismo sustrato,se formaría un intermediario anormal. Se encontró que este polipirrol intermediario lleva ya preformada la estructura de tipo III, pues, cuando se empleó como sustrato, se obtuvieron resultados inesperados en el tipo isomérico de las porfirinas formadas. Los polipirroles se probaron como sustratos de la isomerasa, siendo ésta la primera vez que esta enzima es capaz de formar porfirinas en ausencia de deaminasa. Se determinaron las bandas de absorción del posible intermediario, encontrándose máximos en medio ácido a 330 y 480 nm; cromatografiaron sobre placas de silicagel, obteniéndose diferentes Rf's nara los distintos intermediarios y el PBG.Se sugirió, además, que el intermediario no estaría fuertemente unido a la enzima, y que se trataría de una unión física y no del tipo covalente. En base a los resultados obtenidos, se modificó el esquema de Cornford (1964) y se presenta un mecanismo que concuerda con los datos acumulados hasta el presente. Sin embargo, es necesario aún obtener nuevas evidencias experimentales que permitan apoyar o mejorar el mecanismo propuesto para la condensación enzimática del PBG, y en este aspecto se continúa trabajando en nuestro laboratorio.
