Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial |
| Autor: | Diz de Otamendi, María Elisa |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina - Cátedra de Química Biológica
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| Publicación en la Web: | 2017-11-06 |
| Fecha de defensa: | 1969 |
| Fecha en portada: | 1969 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química (hasta 1976) |
| Director: | Stoppani, Andrés Oscar Manuel |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1348_DizdeOtamendi |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n1348_DizdeOtamendi.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n1348_DizdeOtamendi |
| Ubicación: | 001348 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Diz de Otamendi, María Elisa. (1969). Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1348_DizdeOtamendi |
Resumen:
El estilbestrol a1 igual que las hormonas esteroides,inhibe selectivamente la cadena de transporte de electronesmitocondrial. La NADH oxidasa es mucho más sensibleque la succinato oxidasa, ubicándose inicialmente su sitiode acción en el segmento NADH-(Q,cit b). Se ensayó un fraccionamiento de la cadena, con elobjeto de eliminar sectores no involucrados, utilizándoseparticulas NADH y succinato citocromo c reductasa. En adelante se utilizaron segmentos funcionales, ya quelas modificaciones preparativas introducidas por elfraccionamiento, alteraban las respuestas al estrógeno. Se utilizó el segmento NADH-citocromo b. Con el estilbestroly análogos, se determinaron por espectrofotometríadiferencial modificaciones en los niveles de óxido-reducciónde los componentes de la región "NADH flavoproteína"en primer lugar citocromo b y en segundo lugarflavoproteínas y otros componentes que contribuyen a lasvariaciones espectrofotométricas a 465-510 nm. Se determinóque el estilbestrol produce desplazamientos delnivel de estado estacionario de óxido-reducción del citocromob hacia la oxidación en el sistema aeróbico y coincidentementeuna inhibición de la reducción directa en elsistema inhibido por cianuro. Se tituló el efecto del estrógeno y análogos sobreeste sistema NADH-citocromo b y se encontró que actúancon la misma especificidad que sobre la respiración mitocondrial,sobre la NADH oxidasa y sobre la NADH-Q reductasa,segmento funcional utilizado posteriormente. Losdimetiléteres (fisiológicamente inactivos) no inhibenla transferencia de electrones. La concentración I (50) para estos efectos fué para Stil: 2 μM. Sobre la NADH-oxidasa midiendo consumo de O2polarográficamente, se obtuvo un valor 0.75 μM. Se encontró que el ascorbato potencia significativamente lainhibición por estilbestrol. La antimicina A modifica el flujo de electroneshacia el b por acción sobre dicho componente, además delbloqueo que produce a un sitio inmediato posterior. No seobserva efecto del Stil cuando el parámetro utilizado esreducción del b en sistema anaeróbico por cianuro másantimicina A. El ascorbato es capaz de antagonizar elefecto del antibiótico y restablecer el efecto de Stil. En el sistema cerrado, con cianuro como inhibidorterminal el citocromo b se mueve libremente en presenciade Stil, en un equilibrio de óxido-reducción sumamentesensible a las variaciones del flujo de electronesdesde el NADH. Se ensayó el agregado de Q2 y fumarato. En todos los casos, la reoxidación del citocromo bresulta dependiente de la concentración del estrógeno,en función de su efecto primario: inhibición del transportea un sitio anterior a b. Por lo tanto b no es elsitio de acción del estrógeno. Queda abierta la cuestiónde una posible influencia sobre la conformación del mismo,pero no en relación con el sitio de acción fundamental. El citocromo b, según criterios cinéticos no se encontróalineado en la cadena principal, sino en posición desalto tal como ocurre en general en este tipo de preparacionesno fosforilantes. La reoxidación observada del citocromo ben el sistema cerrado por cianuro se efectuaríaa través de una vía paralela a la vía principal, insensibleal cianuro. En cuanto a las variaciones espectroscópicas a 465-510 nm (flavoproteínas), en el sistema aeróbico, Stil no modifica la reducción y sí la reoxidación. Ensistemas cerrados, inhibidos con cianuro se produceuna curva bifásica de reducción y sí el estrógeno seagrega a la flavoproteína ya reducida, se logra unpequeño aunque significativo desplazamiento hacia laoxidación. Agregando ascorbato al medio de reacción laacción de Stil se potencia, al igual que el caso observadodel citocromo b y el sector NADH-deshidrogenasa seresuelve en dos componentes de óxido-reducción, uno debajo potencial del lado sustrato y otro del lado O2del sitio sensible al Stil. El succinato resulta capazde reducir a este último, además de su correspondienteflavoproteína. Se ensayó la acción de Stil y análogos sobre elsegmento NADH-Q exógena de la cadena respiratoria conidénticos resultados que los comentados para el segmento NADH-citocromo b. Se mantiene el requerimiento de OH fenólicos libres. Las concentraciones inhibidoras 50 %(I50) son para Q2 μM 4.0 (Stil); 7.5 (Hex); 15 (Stil MME)y para Q0 (Stil) 18; (Hex) 15 y (Stil MME) 30. Los dimetiléteres no resultaron activos en ningunode los sistemas ensayados. Se determinó que la disminución de la actividadenzimática en presencia de Stil es proporcional a lacantidad de enzima presente y depende de la concentracióndel inhibidor en la mezcla de reacción. La inhibiciónse revierte por simple dilución de la mezcla enzima/inhibidor. La naturaleza reversible de la inhibiciónpermitió un tratamiento cinético en el estudio de lainhibición sobre el segmento NADH-Q. Se descarta unaprobable competencia entre Stil y quinona ya que losgráficos (Lineweaver y Burk) obtenidos dan una inhibiciónno competitiva de Stil con relación al sitio fundamentalde entrada de la quinona. Los valores de Kiobtenidos confirman la naturaleza no competitiva de lainhibición en cuanto a la reacción de quinona con lacadena al sitio fundamental de entrada. Se hace un cálculorelativo de las contribuciones respectivas a dossitios de entrada de la quinona exógena. Se analiza unasupuesta competencia que resulta de la aparición de unaactividad NADH-Qo insensible al estrógeno a altas concentracionesde quinona. Esta actividad seria la consecuencia de una interacción directa de Qo con el grupo flavina de bajo potencial de la NADH-deshidrogenasa. Como se esperaba, dicha actividad resultó competitivacon respecto al NADH. Se ensaya el efecto de Stil sobre reacciones queinvolucran directamente a dicho grupo flavina talescomo transhidrogenasa y ferricianuro reductasa. El estilbestrolno afecta estas actividades de acuerdo con loencontrado para la actividad NADH-Qo reductasa a altasconcentraciones de la quinona. Se descarta el grupoflavina como sitio de acción del inhibidor. En experimentos de preincubación de la enzima con Stil no directamente comparables se obtienen variacionesde las actividades NADH-citocromo c reductasas yferricianuro reductasa que se deberían a cambios conformacionalesde la NADH deshidrogenasa particulada funcional. En correspondencia se obtiene aumentada reactividad a mercuriales. Todos estos resultados localizan el sitio sensiblesobre el sector NADH deshidrogenasa en las proximidadesdel componente I (excluyendo al grupo flavina), dejandoun segundo componente redox del lado oxígeno. La naturalezade este segundo componente es por el momento discutibleya que se han propuesto dos esquemas diferentes. Se ha ensayado el efecto de Stil y rotenona, resultandoaditivas las inhibiciones ó dando respuestas análogascuando se ensayaron separadamente. Esto indicaríaque ambos inhibidores afectarían al mismo componenteenzimático, no necesariamente al mismo grupo ya que seencontraron diferencias en presencia de ferricianuro yascorbato. Pueden suponerse diferentes mecanismos deacción dada la diferencia de estructuras. Se ha postulado un probable mecanismo de acción enlo que respecta a la acción del estilbestrol y análogos,no comprobado, pero que responde a los hechos experimentalesobservados. El estilbestrol actuaría en este sistemapor su capacidad de producir radicales libres H.,capaces de ceder electrones a un sustrato orgánicoadecuado, grupos disulfuro u otros equivalentes. Elagregado de acido ascórbico potenciaría al sistema porregeneración del difenol a partir de la doble quinona,explicándose así la mayor actividad del sistema acidoascórbico-estilbestrol que el del estilbestrol aislado. El monometiléter tendría menor eficacia ya que daríal H. por mol en lugar de dos. El otro radical sería menosreactivo ya que puede estabilizarse por resonancia. Finalmente los dimetiléteres inactivos formarían bisradicalespero no H., cumpliéndose de esta manera laproporcionalidad del efecto con el número de OH fenólicoslibres. Los experimentos de preincubación aunqueno directamente comparables, sugieren la formación degrupos sulfhidrilos libres ya que se observa aumentadareactividad a mercuriales. El ferricianuro interferiríala reacción a nivel de la enzima compitiendo con elgrupo Prot-S, por el electrón cedido por el átomo dehidrógeno. Esta hipótesis sería válida exclusivamentepara el estilbestrol y análogos en coincidencia con losrequerimientos para su acción estrogénica, no así paralos estrógenos naturales en los cuales no se requieren OH fenólicos libres para la inhibición, como lo pruebala acción de los dimetil-derivados del 17 estradiol.
Citación:
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Diz de Otamendi, María Elisa. (1969). Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1348_DizdeOtamendi
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Diz de Otamendi, María Elisa. "Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1969.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1348_DizdeOtamendi
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