Resumen:
La obtención de cultivos puros de Leptospira a partir de aguas, se realiza con métodos laboriosos, no obteniéndose con frecuencia los resultados deseados. Estas investigaciones revisten interés epidemiológico en el caso de cepas patógenas, mientras que por otro lado el conocimiento de las propiedades antigénicas de las cepas acuícolas y sus variedades será de importancia fundamental para su taxonomía, actualmente sólo en parte definida. Este trabajo está orientado a contribuir al estudio de estos problemas. Se comenzó por el estudio de métodos de aislamiento. Dado que no se deseaba emplear para ello medios que sólo permiten el desarrollo de leptospiras saprófitas, se utilizó en un comienzo el medio de Svino y Rennella modificado, y luego el de Korthof. Las primeras tentativas fueron realizadas mediante la "filtración por cobayo" propuesta por Schuffner, y siembra de la muestra en medio de Savino y Rennella modificado. Se concentraron previamente las leptospiras de las aguas mediante centrifugación diferencial. Con estos métodos no se obtuvieron en ningún caso cultivos de leptospiras; los hemocultivos permanecieron en general estériles, y la siembra directa produjo siempre sólo intensa contaminación. En ensayos realizados empleando combinaciones de activadores del desarrollo y factores de crecimiento de leptospiras, se observó que ciertas sustancias permitieron el desarrollo de una cepa pura, pero no el cultivo de estos microorganismos a partir del agua. En vista de estos resultados se recurrió a la filtración previa de las muestras, a fin de purificarlas antes de efectuar su siembra. Se ensayaron las bujías Pasteur-Chamberland L3, y luego delgunos intentos se pudo comprobar, mediante filtración de suspensiones diluídas de leptospiras, que estos elementos no permitían el paso de dichos microorganismos, al menos en cantidad suficiente. Experiencias similares llevadas a cabo con discos Seitz EKs mostraron que los filtros ensayados presentaban el mismo inconveniente. La búsqueda de un elemento filtrante más adecuado se orientó entonces hacia las membranas. Fueron ensayadas las Millipore tipo HA, en un soporte "Isopor". En ensayos preliminares, estos filtros dejaron pasar una cantidad apreciable de leptospiras y permitieron la separación de éstas de los microorganismos de una muestra de agua adicionada con un cultivo de L. biflexa. Mediante este sistema se aislaron algunas cepas directamente en estado de pureza, pero en otros casos se obtuvieron cultivos de leptospiras intensamente contamínados, que sólo en algunas oportunidades pudieron posteriormente ser purificados mediante filtración por otras membranas de menor tamaño de poro y/o sulfanilamida. Esta irreproducibilidad hizo sospechar la existencia de defectos en el soporte empleado o las membranas HA utilizadas hasta ese momento. Por ello, se realizaron experiencias, filtrando 18 muestras de agua de diversas procedencias, mediante soportes "Swinny", con una nueva partida de membranas de tipo HA (0,45µ +- 0,02 µ), PH (0,30 µ +-0,02 µ) y GE (0,22 µ+-0,02µ), sembrando 3 ó 4 tubos con el filtrado de cada membrana. Además se inocularon las muestras sin filtrar en medio de Korthof con 4% de sulfanilamida y, como control, en agar de Zuelzer. En los tubos sembrados con el filtrado por HA se observó en todos los casos desarrollo de leptospiras, aunque intensamente contaminadas. Con membrana PH también se obtuvieron siempre cultivos de leptospiras, con mucho menor contaminación, y se los logró puros en uno o más tubos en 6 de las 17 muestras ensayadas con estas membranas; en los casos restantes, los contaminantes más frecuentes eran otras espiroquetas. Con membranas GS, se obtuvieron leptospiras puras en 13 de estas 18 muestras, y en otras 2 se comprobó retención de todo microorganismo capaz de desarrollar en medio de Korthof; de otras dos se obtuvieron cultivos siempre asociados con espiroquetas, y además con otros microorganismo en la muestra restante. La siembra en medio con sulfanilamida nunca produjo cultivos de Leptospiras y sí intensa contaminación. Con el agar de Zuelzer se tuvieron 15 cultivos de leptospiras contaminados, luego de 4 a 7 semanas de incubación, mientras que en los 3 restantes no desarrollaron leptospiras. De estos resultados surge la conveniencia de aplicar esta técnica para obtención de leptospiras de aguas, con membrana PH si se desea mayor sensibilidad, purificando luego los cultivos obtenidos, o con GS, si se desea tomar en cuenta sólo los cultivos obtenidos puros. Por su rapidez, simplicidad y eficiencia se sugiere el ensayo de esta técnica para aislamiento de leptospirasde orina y otros materiales contaminados. Para la purificación de cultivos, se ha hallado que el tipo GS da los resultados más satisfactorios. Ensayos realizados con membranas VC (100mµ+-8mµ) y VM(50mµ+-8mµ), indican que éstas retienen las leptospiras. Se ha logrado la purificación de numerosos cultivos obtenidoscontaminados, en particular con otras espiroquetas, empleando sulfanilamida, con lo que se resolvió el problema presentado por estos microorganismos filtrables. Sometiendo algunas cepas aisladas simultáneamente a los ensayos de diferenciación del SO4Cu de Fuzi y Csóka, y a los de Mailloux y Kolochine Erber y de Babudieri y Zardi, se observó que con estos últimos no se obtenían resultados muy satisfactorios con nuestras cepas, por lo cual se aplicó para los 83 cultivos conservados puros la prueba de Fuzi y Csóka, resultando que 13 de ellos eran inhibidos a diluciones 1:40.000 y no a 1:100.000, mientras otros 5 se comportaban de modo análogo a las cepas patógenas. Fueron examinadas las relaciones antigénicas existentes entre 25 cepas aisladas, con 15 de las cuales se prepararon también los inmunosueros correspondientes, y las colecciones de sueros y cepas de todos los suerogrupos patógenos y de leptospiras biflexas del cepario de este Instituto. La selección de cepas fué realizada incluyendo aquellas cuyo desarrollo era más fácilmente inhibido por el SO4Cu, tomando además dos o tres de cada muestra de agua, con el fin de tener idea sobre las variedades que pueden coexistir en una misma agua. Se ha demostrado el aislamiento de cepas diferentes de distintas porsiones del filtrado en 6 sobre 9 muestras seleccionadas al efecto. Los estudios suerológicos realizados han resultado con frecuencia dificultosos, a causa del lento desarrollo de las cepas y su tendencia a autoaglutinar. Han sido halladas cepas de características interesantes; unas, por sus relaciones con el grupo Semaranga- Patoc 1- Sao Paulo, otras por exhibir estrechas vnculaciones asimétricas con la cepa belga Wa Gent, y una por poseerlas con la cepa Ranchos. Estas, y otras que han sido fácilmente inhibidas por el SO4Cu, sí bien no demuestran relaciones antigénicas con las cepas patógenas, o lo hacen a muy bajo título, continuarán siendo posteriormente estudiadas por este Instituto.
Citación:
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Locascio, Guillermo. (1964). Presencia de leptospira en aguas naturales de la República Argentina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1215_Locascio
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Locascio, Guillermo. "Presencia de leptospira en aguas naturales de la República Argentina". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1964.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1215_Locascio
