Resumen:
Purificación de la enzima. Obtención del polvo cetónico de levadura: de acuerdo a latécnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza levedurade panadería (Sacharomyces Cerevisiae) producto comercial,prensado y libre de fécula. Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico 0.092 M, en frío, con agitación ocasional durante 5 días, manteniendoel pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado deamoniaco concentrado. Coagulación por calor de proteina inactiva: se ajusta elpH del sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico 1 M y se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamentey se centrifuga. Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior sele baja el pHa 4.5 mediante el agregado lento de ácido cítrico 1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en elprecipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico 0.025 MpH 6.3. Fraccionamiento salido con sulfato de amonio: se hace medianteel agregado de solución saturada de sulfato de amonio. El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68% de seturación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadorade fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA 1mM, pH 7.0. Filtración a través de gel de dextranos: Sephadex G-200en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equilibradacon amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro depotasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fracciones de mayoractividad especifica se recromatografíanpor la misma columna en iguales condiciones. Propiedades de la enzima. 1.- Especificidad de sustrato: La enzima presenta una especificidadmuy amplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1dehidosalifáticos o aromáticos. Entre los primeros son oxidadosel glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y crotonaldehido;entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido (p-metoxibenzaldehido). No se oxidan el gliceraldehido, p-dimetilaminobenzaldehido niel salicilaldehido. Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensayados,aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dadoque son inhibidores del sistema enzimático cuando éste oxidaal acetaldehido. 2.- Especificidad de coenzima: la aldehido deshidrogenasaademás del NAD reduce al NADP, deamNAD, APAD y APdeamAD. EldeamNAD es el más activo, la velocidad de la reacción es del 88% respecto a la del testigo con NAD,la del NADP es del 33%, APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidospor el sistema enzimático si bien pueden ser reducidos químicamenteo por acción de otras deshidrogenasas. 3.- Necesidad de activadores de la enzima: la NAD aldehidodeshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximo de suactividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacciónes sólo del 14 al 16% de la correspondiente a la presencia decisteina l mM. Si en esas condiciones se agrega al sistema enzimáticoaquellos complejantes de metales que en presencia de cisteinainhiben la acción catalitica (OP, HOQ y DDC)se ve que enausencia de la misma la activan. La adición de cisteina l mM auna preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramentela actividad, pero no tanto como cuando actúa sola. La activaciónde la enzima en función de la concentración de OP llegaa un máximo, concentraciones de OP por encima de ese valor (1 mM)producen inhibición. El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación. Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD.se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausenciade activador depende de la coenzima presente en el sistema enzimático,así con APAD la reacción no se produce, con NAD y APdeam AD lavelocidad de la reacción enzimática es 9 y condeanNADes de 18. Los complejantes no tienen el mismo efecto activador (comparado con la cisteina) cuando los sistemas enzimáticosa los cuales se agregen tienen distintas coenzimas así,con HOQ se tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (deamNAD), 87 (APdeamAD) y 67 (APAD). El estudio de la cinética de activación indica que la OPactúa sobre el KNAD, aumentando la asociación de la coenzimaa la enzima. 4.- inhibidores de la reacción de la NAD aldehido deshidrogenasade levadura: La enzima es inhibida por distintas clasesde compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, análogosy derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sustratoy III) compuestos cuya estructura no está relacinada nicon el sustrato ni con la coenzima, este grupo comprende: a)sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejoscon metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles. I) Análogos del NAD, derivados piridínicos y adenílicos:los componentes de la molécula del NAD,adenina, nicotinamiday sus derivados, asi como los análogos del NAD(PAD, APdeanAD, NADP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibidorescompetitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP, ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN, pirofosfato y fosfato nomodifican la velociiad de la reacción enzimática. II) Inhibición por sustrato y sustancias análogas al sustrato:los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (glicolaldehido,benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores delmismo cuando se los agrega junto con acetaldehido. El salicilaldehidoy el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidadospor la enzima, son inhibidores de la misma, especialmente elúltimo de los nombrados, que cuando se agrega concentración iguala la del acetaldehido inhibe el 100% de la actividad. Encambio el gliceraldehido, que no es oxidado, tampoco es un inhibidorde la enzima. El estudio cinético de la acción de estosaldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetaldehido,no revela un comportamiento definido. III) Compuestos cuya estructura no está relacionada nicon las coenzimas ni con el sustrato: a) Sustancias complejantes de metales: la inhibición por agentesorgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos con metales indica que hay un metal involucrado en la reacción catalizadapor la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la 8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, elα,α´-dipiridilo y la azida sódica tienen muy poca o ningunaacción. Estudios detallados de la influencia de la OP sobre la reacciónde la NAD aldehido deshidrogenasa muestran que esta sustanciaproduce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversibley otra dependiente del tiempo e irreversible. También el dietilditiocarbamatoproduce una inibición irreversible dependientedel tiempo. No se observa lo mismo con el zincón. La inhibición irreversible por OP depende del tiempo de incubación,del grado de pureza de la preparación enzimática. cuantomás pura más sensible a la acción del inhibidor y de la temperaturade incubación, aumenta con la misma. Estudios de protección por distintas sustancias de la inhibiciónirreversible por OP conducen a los siguientes resultados;la cisteina. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolina previenencompletamente la acción de la OP; cianuro y EDTA son tambiénfuertemente protectores. De la coenzima, análogos de la mismay mononucleótidos que la componen sólo el PyAlAD y el PyAldeamADactúan como protectores, los demás o bien potencian la acciónde la OP como el NAD, NADP, ADP y APAD o no ofrecen ningunaacción como la adenina. El pirofosfato es ligeramente protector. El único catión que protege totalmente la enzima de la acciónde la OP es el Zn^++;el K^+; Rb^+ y Sr^++ son algo protectores. Elacetaldehido aumenta ligeramente el efecto inhibidor de la OP. Estudios cinéticos de la acción de la 0P, HOQ y DDC sobrelos complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que lainhibición instantánea es competitiva con el NAD y mixta deltipo competitivo- no competitivo con el acetaldehido. La cinéticaes consistente con la suposición de que se forma un complejoentre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambosestán en relación 1:1. b) Hidroxilamina: la inhibición de la NAD aldehido deshidrogenasapor hidroxilamina depende de qué análogo del NADactúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90% con el APAD o APdeamAD para una concentración de hidroxilamina de 10mM. En iguales condiciones con el NAD o deamNAD la inhibiciónobservada es sólo del 15%. El estudio cinético indica que la hidroxilamina presentauna inhibición incompetitiva respecto de las coenzimas mientrasque para el acetaldehido si la coenzima es NAD o deamNADse observauna inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo,casi puramente competitivo, mientras que cuando el sistema enzimáticaactúa con APAD la inhibición es del tipo competitivo. c) Reastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani y Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sensiblea los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamientode los complejantes de metales frente a la acción del o-iodosobenzoatoy del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQ aumentan la sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tioles. También se vió qué efecto tienen los análogos y componentesdel NAD cuando se los incuba en presencia de los mismos; el NAD, NADP, PyAlAD, PyAldeamAD y deamNAD actúan protegiendo a laenzima. E1 APAD y APdeamAD, sustancias que se sabe que se combinancon la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan lainhibición por los reactivos de tioles utilizados. Los mononucleótidosadenilicos AMP, ADP y ATP son protectores, aunque notanto como el dinucleótido; el piridinico es mucho menos eficaz.
Citación:
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Schwarcz, Martha Norma. (1964). Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae). (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1191_Schwarcz
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Schwarcz, Martha Norma. "Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1964.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1191_Schwarcz
