Resumen:
Sobre fosfátidos de vegetales, cuyos principales componentes nos propusimos determinar en el presente trabajo, la bibliografía es bastante menor que en caso de fosfolípidos de fuentes animales. La cantidad de fosfátidos presente en soya y trigovaría con el procedimiento de extracción, procedencia de lamuestra, calidad de la misma, época del año etc, hallándose para soya valores desde 1,5% hasta 3,2% y de 0,6% hasta 1,6% ongermen de trigo. Los constituyentes de los fosfolípidos en vegetales seidentificaron con los de fuentes animales, con la única diferenciade no haberse hallado esfingomielina en los primeros, hastael presente,. La característica de fosfolípidos de soya y trigoen su existencia en forma de complejos carbohidrato- fosfátidoproteína, cuya naturaleza, en la mayoría de los casos, no es detipo químico, ya que los fosfátidos se liberan totalmente poracción de solventes específicos. Para la determinación de los fosfátidos totales, es necesariouna extracción completa del material y valoración delos mismos en el extracto. Se trabajó con un germen de trigo argentino, procedentede Pergamino. Luego de una molienda conveniente del germen, selo extraía de acuerdo a la técnica de Rewald (1937) C.A. 31,6354.en un aparato continuo con una mezcla de benceno-alcohol(4:1)durante 36 hs o igual tiempo con alcohol de 96%. Una vez aislados los fosfolípidos, pueden seguirse 3 caminos para su valoración: a) el método oxidativo o de Bloor, b) por el contenido enácidos grasos y c) por determinación del contenido en P. Este último método es el más común y exacto, por la cantidad de técnicas existentes para valorar este elemento y fué el adaptadopor nosotros. Para ello, el residuo, de la extracción, luego deeliminar el solvente y secado convenientemente a vacío, se sometíaa hidrólisis con ClH 6N a ebullición durante 24 hs, con elobjeto de liberar las bases nitrogenadas de los fosfátidos, de la unióncon el ácido fosfórico, obteniéndose así ác. fosfóglicéricoclorhidrato de colina, colamina, serina y ácidos grasos, que seeliminan luego por filtración. Sobre ese hidrolizado se determinaba P y las bases nitrogenadas. Para P, se usó un método colorimétrico, debido a Beveridge y Johnson (l949) Can. J. Research 27, E, 159, consistente en la conversión del ác. fosfórico a ác.fosfomolíbdico y su posterior reducción a azul de Mo. El reactivo consistía en Sulfato de hidrazina-molibdato de sodio. El color azul obtenido era estable 24 hs y su intensidad se medía con el espectrofotómetro. De todas las determinaciones efectuadas sobre 2 muestrasdistintas de germen de trigo, se obtuvo el valor promedio de 1,58%de fosfátidos totales, con un máximo de 1,6% y un mínimo de 1,57%. Con igual técnica se analizaron 2 muestras de Lecitina desoya comercial, hallándose un promedio de 49,76% de fosfátidos totales. La determinación en los constituyentes principales de losfosfátidos es importante por su rol en los procesos metabólicos. Para ello pueden separarse previamente las distintas fracciones que los contienen: lecitinas, cefalinas e inositol fosfátidosy determinar cada una en la fracción correspondiente o bien valorarlasdirectamente en el hidrolizado. Este último es lo más aceptable para microcantidades como en nuestro caso, ya que estásujeto a menos fuentes de error. De los métodos existentes para la localización y valoración de colina, colamina y serina por precipitación de sales insolubles, colorimétricos etc, se deduce que los cromatográficos, desarrollados en los últimos años, son los más rápidos, convenientesy precisos para el análisis de microcantidades de estas sustancias. Se aplicaron a los hidrolizados de germen de trigo y lecitinade soya, técnicas cromatográficas sobre papel, descriptas para elcaso de constituyentes de fosfolípidos cerebrales. (Levine, Chargaffy Green: J. Biol Chem 175, 67 (1948)). Se ha desarrollado un mismo cromatograma para la localizacionde colamina y serina y otro aparte para colina; en todos los casosel papel usado fue Sleicher Schull N° 597. Se cortaron rectángulosde papel de 50 cm de altura y ancho variable según las muestras adesarrollar y a 2,2 cm del borde inferior se colocaban gotas de 0,01 cc con una pipeta capilar calibrada y suficientemente separadas yse sometían a cromatografía unidimensional durante 18 hrs en cámaras de vidrio herméticamente aisladas y saturadas previamente conel solvente a usar. Los solventes usados fueron: a) n-BuOH - Morfolina (3:1); b) n-BuOH - Piridina (4:1); c) n-BuOH - Dioxano (4:1) y n- BuOH - Agua - Amoníaco (50:7:3). La técnica de revelado era común para colamina y serina; lospapeles se secaban al aire (solvente a) ó a 90° (solventes b, c y d) durante 30 a 60 minutos; luego se pulverizaban con solución deninhidrina al 0,1% en n-BuOH y luego de 5-10 minutos de calentamiento en estufa a 90°C, se desarrollaba el color rosado de las zonasocupadas por estas sustancias. Para localizar colina, se secaban los papeles al aires y luego en estufa, se pulverizaban con solución acuosa de ác. fosfomolíbdico al 2% y se lavaban en inmersión en n-BuOH y luego en agua. Finalmente se sumergían en solución recién preparada de Cl2Sn al 0,4%en ClH 3N y de este modo las manchas amarillas tenues de fosfmolibdato de colina, se transformaban en manchas azules bien definidas,de azul de molibdeno. Estas manchas cumplen la Ley de Beer y se aprovechó esta circunstancia para su determinación cuantitativa, pormedición de la intensidad del color de las mismas con un densitómetro se medían las áreas correspondientes con un planimetro y el contenido de colina se hallaba mediante un cálculo simple. Para la determinación cuantitativa de colamina y serina, se usó latécnica de Naftalin: Nature 161, 763 (1948). Se localizaban las manchas con solución al 0,05% de ninhidrina en n-BuOH y se recortabandejando un margen. Se colocaban en tubos de ensayo y se trataban consolución bufferizada de ninhidrina al 5% en n-BuOH y se colocabanen baño de agua para desarrollar el color violáceo, estable aproximadamente 12 hrs. Las intensidades de color se leían en un espectrofotómetro previamente calibrado y a 650 mu. En todos los casos se operó al mismo tiempo con el hidrolizadode lecitina de soya. Los valores obtenidos para estas 3 sustancias,coinciden, dentro de ciertos márgenes, con los hallados en la literatura. (ver tabla de valores en los tesis). CONCLUSIONES 1) Se ha encontrado que la cantidad de fosfolípidos totales obtenida con el método de valoración de P, está de acuerdo con la halladaen la literatura para esta tipo de material. 2) Dada la pequeñísima proporción en que se hallan la colina, colamina y serina en los vegetales, se aplicaron técnicas cromatográficas sobre papel para su caracterización, separación y determinación cuantitativa, las que han sido ampliamente desarrolladas para elcaso de componentes de fosfolípidos de cerebro. 3) Se ensayó el uso de diversos solventes: n-BuOH - Morfolina (3:1);nBuOH-Dioxano(4:1) (b)nBuOH-Piridina(4:1) (c) y nBuOH-NH3-H2O (50:3:7) (d) determinándose los Rf correspondientes a las tressustancias, previo ajuste de las técnicas mediante el uso desustancias puras. 4) La serina y colamina se revelaron en un mismo cromatogramay la de colina en cromatograma aparte, usando las mismas técnicasque en el caso de fosfolípidos cerebrales. 5) La localización de serina y colamina, desarrolladas con solvente (c), se hizo además mediante el uso de luz ultravioleta, de acuerdo a la técnica de Philips. 6) Se eligió para cada sustancia el solvente con el que se obtenían manchas más nítidas y se ensayó en ellos la "Cromatografía cuantitativa". Se determinó además en cada caso, el límite deconcentración de sustancia necesario para su identificación cromatográficay el rango preferido para la misma. La Colina se valoró por densitometría del color azul obtenido reduciendo las manchas de fosfomolibdato de colina con Cl2Sn en el papel. Los valores obtenidos son: (ver tabla de valores en la tesis). Las determinaciones efectuadas con colina pura empleando el mismo método, indican que dicho método da valores correctos. 7) La valoración de Colamina y Serina se realizó usando técnicascombinadas de cromatografía en papel con métodos cuantitativosstandrad. Encontramos que el solvente (b) es el que daba los mejoresresultados por la diferencia de valores de los Rf. 8) La aplicación del método de Naftalin (93) de elución de lasmanchas de la reacción con la ninhidrina y su medición con elespectrofotómetro, para aminoácidos, dió muy buenos resultadoscon Serina y se encontró que es también aplicable, con ligerasmodificaciones, en el caso de la Colamina, hallándolo válidodentro de un amplio margen de concentraciones de la misma. 9) En todas las etapas del trabajo, se realizaron simultáneamentelas mismas determinaciones sobre una muestra de Lecitinade soya comercial, como control y guía, dado su reconocidocontenido en Colina, Colamina y Serina. 10) Los valores obtenidos con la aplicación por vez primera delas técnicas descriptas a este tipo de material, son del ordende las halladas por otros autores con los métodos comunes de la Química analítica cuantitativa, solo que con la aplicación existosade la cromatografía, disponemos de un método rápido, elegante y relativamente sencillo para la determinación de Colina, Colamina y Serina en cereales, que de otro modo sería largo ytedioso dada la complejidad del material.
