Resumen:
-1- Empleando el método cuyos detalles su dan en la página 33,es posible dosar la creatinina, en concentraciones comprendidasentre 0.000 5 M (0.056 mg. por cc.) y 0.008 M (0.905 mg.por cc)con error probable (por cada determinación) inferior al 2%, exceptopara el extremo correspondiente a la máxima dilución, en dondeel error probable supera apenas ese valor y es de 2.2%. Para obtener esa precisión es necesario cuidar cada uno delos detalles de la técnica descripta, en particular, los siguientes: a) - Calibrar la pipeta con que se mide el volumen de la muestra (1 cc) asegurándose de que en su medición se cometen erroresdespreciables. Calibrar, también, el balón aforado de 100 cc. Por lo generalestos balones son suficientemente exactos como para poder ser usadosen un método fotométrico (error muy inferior al 0.5%).b - Construir las curvas de calibrado con standards suficientementepuros.c - Usar ácido pícrico purificada y controlado como se dice en laspáginas 47 y 75. No es necesario medir el volumen de la soluciónde ácido pícrico con gran exactitud. Folin(52) empleabaprobetas. Nosotros hemos usado pipetas de doble aforo.d - En cambio es imprescindible agregar una cantidad exactamentemedida de álcali. Hay que cuidar, por un lado que la concentraciónsea realmente del 10%, y por el otro, que el volumen agregadosea exactamente 1.5 cc. para lo cual conviene emplear una buretacalibrada. La concentración del álcali tiene, en efecto, una graninfluencia, tanto sobre el desarrollo del color (la fase de la reacción),como sobre los cambios, más o menos notables de su intensidad,que se producen después de diluir (2a. fase).e - Diluir con agua destilada hasta el aforo (100cc) exactamente 10 minutos después de agregar el álcali. Durante este intervalose deja en reposo, después de mezclar bien.f - Realizar la medición fotométrica en un intervalo no mayor de 5 minutos contados a partir del instante en que se diluyó.g - Usar para cada concentración cubas de espesor adecuado,de modo que la transparencia no sea inferior a 10% ni superior a 63%.h - Llevar a cero el fotómetro antes de cada medición pues varíadiariamente. Para eso se llenan ambas cubas con la solución decompensación, se fija la abertura del tambor de la izquierda de modoque corresponda a una trasparencia de 30.0% y se determina latransparencia aparente, accionando el tambor de la derecha. Se regulala iluminación incidente sobre una y otra cuba hasta que elpromedio de las lecturas en el tambor derecho, de un error inferioral 1%, es decir, esté comprendido entre 29.7% y 30,3%. Solodespués de haber llevado a cero de este modo se vacía la cuba izquierda,y se le llena con la solución problema, se fija su aberturaen un valor correspondiente a 100.0% de transparencia y se hacela medición fotométrica manipulando el tambor derecho.i - Proceder para el dosaje exactamente del mismo modo que se procediópara el calibrado, en particular: usar el mismo filtro y lasmismas cubas. -2- Hemos encontradoventajoso el uso de las diversas solucionesen las proporciones del método de Folin de 1914(52) que tambiénadoptaron Lieb y Zacherl(103). El método de Folin de 1904(35) tiene dos :a - La intensidad de la coloración es menor porque la concentracióndel alcali en la primera fase es mayor (ver cuadro de la página 27, línea S/Vl) (véase también: III - Desarrollo de la coloracióndespués de agregar el áIcali, página 50).b - El fading después de diluir es mas pronunciado, porque la concentracióndel alcali y la del ácido son, entonces, menores. Consultése,por un lado el cuadro de la página 27, línea 10^3.S/V2 y 10^3.P/V2, y por el otro "IV-Fading en la solución diluída", pag. 54. El método de Edgar(85) tiene los mismos inconvenientes:a - por la misma razón (la concentración del álcali es aún mayor)b - porque, aunque la concentración del álcali es algo mayor queen el método de Folin de 1914, la concentración del ácido pícricoes mucho menor. (consultése el mismo cuadro, misma línea). -3- En cuanto a los standards, el picrato de creatinina tiene laventaja de que su pureza puede controlarse fácilmente por presentarun punto de fusión nítido. Una muestra de picrato que funda a 205°, aunque no rigurosamentepura, puesto que su punto de fusión se eleva lentamente porcristalizaciones sucesivas, es suficientemente pura a los efectosde ser usada como standard es este método fotométrico, puesto queda, dentro de los límites de error del método, las mismas lecturasque un picrato que funde a 208° y que ha sido obtenido al cabo dequince cristalizaciones sucesivas. Este standard tiene, sin embargodos inconvenientes de índole práctica. l) es muy poco soluble y 2) se disuelve con excesiva lentitud. De todos los standards el que nos resultó más práctico fueel cloruro de zinc-creatinina: es suficientemente soluble, se disuelverápidamente, tiene un porcentaje muy pequeño de humedad, esmuy poco higroscópico y nos resultó fácil obtenerlo al estado de pureza. Entre las páginas 35 y 45 se indican los métodos de preparacióny purificación de los standards probados y se discuten susventajas e inconvenientes. -4- Comparando nuestrosresultados, obtenidos empleando el filtro S50,con los que obtienen Lieb y Zacherl(103) empleando el filtro S53, podemos decir que, en nuestra opinión, siempre que se dispongade ambos filtros, es preferible el S53, que presenta dos ventajasprincipales:a - En su zona, el picrato alcalino no presenta absorción apreciable,lo que reduce los errores que pueden provenir de este reactivo. La absorción del picrato alcalino en la zona del S50, si bienno grande, es bien perceptible, lo cual nos obliga, por otra parte,a usar picrato alcalino en la cuba de compensación, mientrasque Lieb y Zacherl usan agua destilada.b - En su zona, el coeficiente de extinción específico del color de Jaffé es casi rigurosamente constante, mientras que en la zona del S50 varía mucho, de tal modo que en la zona del S53, la concentraciónde la creatinina es mucho más aproximadamente proporcionalal coeficiente de extinción. Sin embargo, como dijimos más arriba (Resumen 1 - pag.95)empleando el filtro S50, siempre que se tomen las precauciones allíindicadas, se puede dosar la creatinina, entre los límites de concentracióntambién indicados, con errores probables inferiores al 2%. El filtro S50 tiene una ventaja con respecto al S53: el coeficientede extinción específico en su zona es mayor que en la zona del S53. -5- En cuanto al dosaje de creatina (pag.79) hemos encontrado que procediendo en las condiciones del método de autoclave de Folin(86) pero calentando a 121°, en vez de 115-120° y durante 80 minutos, en vez de 20 minutos se obtiene una transformación de 98.4% de la creatina en creatinina. El errorprobable que obtuvimos empleando creatina 0.004% M fué de ±0.6%,muy parecido al obtenido dosandocreatinina de igual concentración, que fué de ± 0.9%. Estos resultados, como puede verse en el cuadro de la página 89 son muy semejantes a los de Lambert(152) y muy superiores a losde Albanese y Wangerin(151). Debemos notar, sin embargo, que todos estamosde acuerdo con Albanese y Wangerin en que un calentamiento de 20 minutos (Folin),produce una transformación muy incompleta, y es precisamente Lambert quien obtiene los resultados más bajos al cabode ese intervalo. -6- En lo que se refiere a la destrucción de la creatinina porcalentamiento en presencia y en ausencia de ácido pícrico (pag. 91)nuestros resultados también concuerdan con los de Lambert y difieren de los de Albanese y Wangerin. Calentando creatinina 0.004 M., 80 minutos a 121°, en las condicionesen que se realiza el dosaje de creatina se destruyó soloun 2% de la creatinina mientras que calentando en la misma forma peroen ausencia de ácido pícrico, se destruyeron 34.3%. Estos resultados confirman las conclusiones de Lambert: queel método propuesto por Albanese y wangerin (página 87) debe dar,necesariamente, resultados altos para la creatina en presencia decantidades considerablemente mayores de creatinina, con errores muysuperiores a los del método de Folin. El método descrito en la página 79 para el dosaje de creatina,además de la ventaja de dar resultados perfectamente reproductibles,con una transformación casi cuantitativa en creatinina, presentauna seria de ventajas prácticas.a - Los reactivos son cualitativamente y cuantitativamente iguales que para el dosaje de la creatinina. La diferencia entre ellos es la mínima indispensable: calentamiento después de agregar el acido pícrico, para transformar la creatina en creatinina. Como la transformaciónes bastante completa (98.4%) para creatinina 0.004 M) yrazonablemente reproductible (error probable de ± 0.6%) y como hemoscomprobado que la creatinina preexistente solo se destruye en un 2.0% (para igual concentración, y con error probable de ±0.8%)es evidente que podemos usar para la creatina la misma curva de calibradoque para la creatinina, obteniéndola por diferencia entrela creatina encontrada después del calentamiento con ácido pícricosegún se dice en la página 79 y la creatina preexistente, dosadasegún se dice en la página 33. Habrá que introducir tan solo pequeñascorrecciones que dependen solamente de las únicas variables:las concentraciones de creatinina y creatina. Si ambas son próximasa 0.004 M., habrá que agregar a la creatinina encontrada después decalentar un 2.0% de la creatinina preexistente, y a la creatina obtenidapor diferencia entre esta "creatinina total" (corregida) y lacreatinina preexistente, habrá que ag Consulte el resumen completo en el documento.
