Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | MICA como blanco farmacológico para la inmunoterapia del cáncer |
| Autor: | Gaillardou, María Eugenia |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Fundación del Instituto de Biología y Medicina Experimental - CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
|
| Fecha de defensa: | 2025-03-17 |
| Fecha en portada: | Marzo 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Zwirner, Norberto Walter |
| Consejero: | Srebrow, Anabella |
| Jurado: | Gazzaniga, Silvina Noemí; Tateosian, Nancy Liliana; Carrera Silva, Eugenio Antonio |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001788_Gaillardou |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001788_Gaillardou.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001788_Gaillardou |
| Ubicación: | Dep.BIO 001788 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Gaillardou, María Eugenia. (2025). MICA como blanco farmacológico para la inmunoterapia del cáncer. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001788_Gaillardou |
Resumen:
MICA (MHC class I chain related protein A) es una proteína humana de membrana inducida por estrés que funciona como ligando del receptor activador NKG2D (CD314), expresado en las células NK y los linfocitos T CD8. La proteína MICA se expresa de forma selectiva en casi todos los tipos de tumores, pero no en tejidos sanos, lo que facilita su eliminación por las células del sistema inmune. Sin embargo, se ha descrito clivaje proteolítico y el desprendimiento del ectodominio de MICA como molécula soluble (sMICA), la que promueve la inmunoevasión debido a que bloquea a NKG2D en células NK infiltrantes del tumor e impiden su correcta activación y función. En nuestro laboratorio se desarrolló un anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-MICA no bloqueante (denominado D7) que demostró tener potencial terapéutico, ya que retrasa el crecimiento tumoral en modelos preclínicos. Sin embargo, aún se desconoce con precisión su mecanismo de acción in vivo, especialmente si es efectivo contra tumores que expresan MICA en superficie porque promueve la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC o antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) por células NK y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP o antibody dependent cell-mediated phagocytosis) por macrófagos, y/o porque promueve la depuración (scavenging) de sMICA por macrófagos. Elucidar estas cuestiones contribuirá a mapear el panorama competitivo del AcMo D7. Con el fin de producir las herramientas indispensables para conocer si D7 es efectivo contra tumores que expresan MICA en superficie o contra tumores que producen sMICA, se propuso como objetivo de esta Tesis de Licenciatura la generación de líneas murinas que expresen una variante de MICA que no pueda secretarse (MICA*001-SD o shedding disabled) y líneas que expresen otra variante que solamente sea secretada (MICA*001-SO o shedding only), empleando el sistema de tercera generación de vectores lentivirales. Los plásmidos de expresión codifican además para eGFP. Se produjo y utilizó sobrenadante con partículas pseudo-lentivirales para transducir células murinas Renca (carcinoma renal de células claras), 4T1 (carcinoma mamario triple negativo) y EL4 (linfoma). El éxito de la transducción lentiviral, y la expresión de sMICA y MICA de membrana fue evaluado mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, ELISA y mediante un inmunoensayo en fase heterogénea basado en FRET. Se afrontaron diversas dificultades para alcanzar el objetivo propuesto. En primer lugar, se detectó la linealización o la presencia de conformaciones defectuosas en los plásmidos accesorios utilizados. Por ello, fue necesario producir un nuevo lote de plásmidos. Una vez purificados todos los plásmidos nuevamente, se produjo sobrenadante viral fresco y se repitió el protocolo en reiteradas ocasiones, utilizando sobrenadante viral concentrado y sin concentrar. Se obtuvieron células 4T1-MICA*001 y EL4-MICA*001 para ambas variantes, y Renca-MICA*001-SO resistentes al antibiótico de selección, pero sin detectar eGFP al microscopio de fluorescencia. Para el caso de 4T1-MICA*001-SO, y EL4-MICA*001-SO y SD se encontraron poblaciones positivas para eGFP con el protocolo de marcación intracitoplasmática en citometría de flujo. Solamente se detectó la presencia de MICA intracitoplasmática en las líneas EL4-MICA*001-SO y EL4- MICA*001-SD. A pesar de los sucesivos intentos con las tres líneas murinas propuestas, solo se obtuvieron exitosamente dos líneas estables expresando el gen de interés: EL4-MICA*001-SO y EL4- MICA*001-SD, aunque estos resultados deben validarse. Se destaca el aporte experimental en cuanto a la generación de las mismas, ya que este trabajo contribuye con herramientas experimentales que son el punto inicial de un proyecto de investigación traslacional en desarrollo en el laboratorio, que tiene como objetivo final dilucidar los mecanismos terapéuticos in vivo de nuestro AcMo anti-MICA.
Abstract:
MICA as a pharmacological target in cancer MICA (MHC class I chain-related protein A) is a key stress-induced human protein that is often overexpressed in tumor cells but typically absent in healthy tissues. It serves as an activating ligand for NKG2D, a receptor expressed on NK (natural killer) and CD8+ T lymphocytes. The recognition of MICA by NKG2D triggers cytotoxicity and IFN-γ production, thereby promoting tumor elimination (immunosurveillance). However, proteolytic cleavage generates a soluble form of MICA (sMICA) that can bind to NKG2D and blocking NK cell effector functions, facilitating tumor immune escape (immunoevasion). Our laboratory previously developed a non-blocking anti-MICA monoclonal antibody (mAb), called D7, that has shown therapeutic efficiency in preclinical models. Administration of D7 delays the growth of MICA-expressing tumors via antibody-dependent-cell-mediated cytotoxicity (ADCC) by NK cells, antibody- dependent-cell-mediated phagocytosis (ADCP) and/or scavenging of sMICA by tumor-associated macrophages (TAM). However, the in vivo mechanism of action of D7 remains poorly understood. It is crucial to elucidate the contribution of each mechanism to assess D7 competitive landscape and to properly design potential clinical trials with our mAb. To address these issues, the main objective of this thesis was to produce stable tumor murine cell lines expressing two variants of MICA: a shedding-disabled version (MICA*001-SD) and a shedding-only version (MICA*001-SO), using third generation lentiviral particles that also encode eGFP. Lentiviral particles encoding cDNA MICA variants were produced and they were used to transduce Renca (mouse clear cell renal cell carcinoma), 4T1 (mouse triple-negative mammary adenocarcinoma) and EL4 (mouse lymphoma) cell lines. Flow cytometry, ELISA, heterogeneous FRET-based fluorescent immunoassay and epifluorescence microscopy were used to evaluate cell surface expression of MICA and sMICA production in cell supernatants. Several challenges had to be overcome to achieve the proposed objectives. First, linearization or defective conformations of the accessory plasmids used was detected. Therefore, it was necessary to produce a new batch of these plasmids. So, fresh viral supernatants were produced, and they were used in new transduction attempts. Once the concentrated supernatant was used, 4T1 and EL4 both MICA*001-SO and MICA*001-SD cells, as well as Renca- MICA*001-SO cells resistant to the selection antibiotic puromycin were obtained. However, no eGFP was observed by fluorescence microscopy. Positive populations for eGFP in 4T1- MICA*001-SO and both modified EL4 cell lines were detected by intracellular staining flow cytometry. The presence of intracellular MICA was only detected in EL4-MICA*001-SO and EL4-MICA*001-SD cell lines. Several experiments were carried out to obtained stable modified cell lines from Renca, 4T1 and EL4. However, only two stable cell lines expressing the gene of interest were successfully generated: EL4-MICA*001-SO and EL4-MICA*001-SD; these results must be validated though. These cell lines expressing both MICA variants are the starting point of a broader project aimed at elucidating the in vivo therapeutic mechanisms of our anti-MICA mAb. Hence, it is important to emphasize that this work provides experimental tools that are crucial for the development of the ongoing translational research project in our laboratory.
Citación:
---------- APA ----------
Gaillardou, María Eugenia. (2025). MICA como blanco farmacológico para la inmunoterapia del cáncer. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001788_Gaillardou
---------- CHICAGO ----------
Gaillardou, María Eugenia. "MICA como blanco farmacológico para la inmunoterapia del cáncer". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001788_Gaillardou
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