Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Modulación de la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria por el ARN de Brucella abortus : su rol en la inmunopatología de la brucelosis humana |
| Título alternativo: | Modulation of megakaryopoiesis and platelet biogenesis by Brucela abortus RNA : its role in the immunopathology of human brucellosis |
| Autor: | Bueno, Jorgelina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Medicina Experimental (IMEX)
|
| Fecha de defensa: | 2025-03-14 |
| Fecha en portada: | Marzo, 2005 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Barrionuevo, Paula |
| Jurado: | Glembotsky, Ana Claudia; Ferrero, Mariana; Tribelli, Paula María |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001783_Bueno |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001783_Bueno.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001783_Bueno |
| Ubicación: | Dep.BIO 001783 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Bueno, Jorgelina. (2025). Modulación de la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria por el ARN de Brucella abortus : su rol en la inmunopatología de la brucelosis humana. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001783_Bueno |
Resumen:
La trombocitopenia, o reducción en el número de plaquetas circulantes, es una de las anormalidades hematológicas más frecuentes asociadas con la infección por Brucella. Muchas causas podrían explicar la disminución en el recuento plaquetario observado en pacientes con brucelosis, entre ellas, el secuestro de plaquetas en el bazo a causa de hiperesplenismo, la disminución en la producción de plaquetas a partir de sus células progenitoras (los megacariocitos (MCs) residentes en médula ósea) o la destrucción de plaquetas por mecanismos inmunológicos (púrpura trombocitopénica idiopática) o no inmunológicos, como alguna coagulopatía de consumo. Sin embargo, las causas de esta condición aún no han sido esclarecidas. En estudios previos, hemos demostrado que las plaquetas son capaces de establecer complejos con monocitos y neutrófilos, lo que podría contribuir a la trombocitopenia observada. Además, Brucella abortus (Ba) puede detectarse en cultivos de médula ósea de pacientes con brucelosis. Asimismo, los MCs se generan a partir de células progenitoras hematopoyéticas (HSCs) residentes en la médula ósea, en un proceso denominado megacariopoyesis mientras que la biogénesis plaquetaria tiene lugar en estas células en un proceso denominado trombopoyesis. Esto nos llevó a proponer que Brucella podría afectar directamente la megacariopoyesis y/o la trombopoyesis, contribuyendo a la trombocitopenia observada. Por otro lado, hemos demostrado que el ARN de Ba (un PAMP relacionado con la viabilidad de los patógenos o vita-PAMP) está involucrado en la inmunomodulación de los monocitos/macrófagos. Más aún, recientemente demostramos que el ARN de Ba es capaz de modular células epiteliales y endoteliales. Por lo tanto, postulamos al ARN de Ba como un potencial modulador de la megacario/trombopoyesis en médula ósea. A su vez, estudios previos sugieren que la inflamación y la infección pueden modular la producción de plaquetas mediante los receptores de tipo toll (TLRs, por sus siglas en inglés). Es por esto que resulta relevante evaluar el rol de los TLRs de reconocimiento de ARN como TLR3, TLR7 y TLR8. Asimismo, con el objetivo de obtener una visión más integral de la interacción bacteria-HSCs en médula ósea, nos propusimos evaluar la capacidad modulatoria de componentes estructurales de Ba (utilizando HKBA, del inglés, Heat Killed Brucella abortus) sobre la megacario/trombopoyesis. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue evaluar el efecto del ARN de Ba y HKBA tanto en la formación de complejos plaqueta-leucocito como en la modulación de la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria con el fin de explorar diferentes mecanismos posibles que podrían explicar la trombocitopenia. Nuestros resultados mostraron que tanto el ARN de Ba como HKBA fueron capaces de establecer complejos plaqueta-neutrófilo, y observamos una leve tendencia a la formación de complejos plaqueta-monocito. Para la megacariopoyesis, las HSCs (células CD34+) purificadas de sangre de cordón umbilical humano fueron diferenciadas a MCs con trombopoyetina (TPO) en presencia de diferentes dosis de ARN de Ba o HKBA. Después de 11 días de cultivo, determinamos la proliferación celular y la expresión de los marcadores de diferenciación de MC (CD41) y maduración de MC (CD42b) mediante citometría de flujo. Nuestros resultados demostraron que el ARN de Ba disminuyó significativamente el número total de células de manera dosis-dependiente. Además, la dosis más alta de ARN de Ba redujo significativamente el comisionamiento hacia el linaje megacariocitico (células CD41+/CD42b−) y la maduración de MCs (células CD41+/CD42b+). HKBA también disminuyó el número total de células, más no interfiere con el comisionamiento hacia el linaje megacariocítico ni con la maduración de MCs. En conjunto, nuestros resultados indican que tanto el ARN de Ba como HKBA inhiben la megacariopoyesis. Sin embargo, la afectan a distintos niveles. El ARN de Ba es capaz de inhibir la proliferación celular de las HSC, el comisionamiento a megacariocitos y la maduración de los mismos. Por su parte, HKBA afectaría la megacariopoyesis sólo por inhibir la proliferación celular de las HSC. Posteriormente, evaluamos el efecto del ARN de Ba y HKBA en la trombopoyesis. Para ello, las células CD34+ fueron diferenciadas a MCs con TPO y estimuladas el día 0 o el día 11 de cultivo en presencia de diferentes dosis de ARN de Ba o HKBA. El día 16, se evaluó la producción de plaquetas en ambas condiciones de cultivo. Para el caso de las células estimuladas en el día 11, nuestros resultados muestran una tendencia a la reducción (para el caso del ARN de Ba) y una reducción significativa (para el caso de HKBA) en la producción de plaquetas. Por lo tanto, el ARN de Ba y HKBA parecieran afectar la trombopoyesis una vez completada la megacariopoyesis. Por último, comenzamos a evaluar el rol de los TLRs capaces de sensar ARN en la modulación de la megacario/trombopoyesis mediada por el ARN de Ba. Para ello, las células CD34+ fueron pre-tratadas con los antagonistas del TLR7 o del TLR7/8 en presencia del ARN de Ba. Resultados preliminares mostraron que aún en presencia de los antagonistas de los TLRs 7 y 8 el ARN de Ba fue capaz de modular negativamente tanto la megacariopoyesis como la trombopoyesis. Futuros experimentos serán destinados a explorar los posibles receptores implicados en dichos fenómenos. En suma, nuestros resultados sugieren que el ARN de Ba es un vita-PAMP capaz de modular la formación de complejos plaqueta-leucocito así como también es capaz de modular la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria al entrar en contacto con progenitores hematopoyéticos (CD34+) y MCs en médula ósea. Asimismo, componentes estructurales de Ba también estarían involucrados en dichos fenómenos. Esto podría explicar, al menos en parte, la trombocitopenia observada en la cronicidad de la enfermedad.
Abstract:
Thrombocytopenia, or a reduction in the number of circulating platelets, is one of the most common hematological abnormalities associated with Brucella infection. Many factors could explain the decrease in platelet count observed in patients with brucellosis, including platelet sequestration in the spleen due to hypersplenism, reduced platelet production from their progenitor cells (megakaryocytes (MKs) residing in the bone marrow), or platelet destruction through immunological (idiopathic thrombocytopenic purpura) or non-immunological mechanisms, such as a consumptive coagulopathy. However, the causes of this condition have not yet been fully elucidated. In previous studies, we have demonstrated that platelets are capable of forming complexes with monocytes and neutrophils, which could contribute to the observed thrombocytopenia. Additionally, Brucella abortus (Ba) can be detected in bone marrow cultures from patients with brucellosis. Likewise, MKs are generated from hematopoietic stem cells (HSCs) residing in the bone marrow through a process known as megakaryopoiesis, while platelet biogenesis takes place in these cells in a process called thrombopoiesis. This led us to propose that Brucella might directly affect megakaryopoiesis and/or thrombopoiesis, contributing to the observed thrombocytopenia. Furthermore, we have demonstrated that Ba RNA (a PAMP associated with pathogen viability or vita-PAMP) is involved in monocyte/macrophage immunomodulation. Moreover, we recently demonstrated that Ba RNA can modulate epithelial and endothelial cells. Therefore, we hypothesize that Ba RNA is a potential modulator of megakaryo/thrombopoiesis in the bone marrow. Additionally, previous studies suggest that inflammation and infection can modulate platelet production via Toll-like receptors (TLRs). For this reason, it is important to evaluate the role of RNA-sensing TLRs such as TLR3, TLR7, and TLR8. To gain a more comprehensive understanding of the bacterium-HSC interaction in the bone marrow, we also aimed to assess the modulatory capacity of structural components of Ba (using HKBA, Heat-Killed Brucella abortus) on megakaryo/thrombopoiesis. Thus, the general objective of this thesis was to evaluate the effects of Ba RNA and HKBA both on the formation of platelet - leukocyte complexes, and on the modulation of megakaryopoiesis and platelet biogenesis in order to explore different possible mechanisms that might explain thrombocytopenia. Our results showed that both Ba RNA and HKBA were capable of establishing platelet-neutrophil complexes, and we observed a slight tendency towards the formation of platelet-monocyte complexes. For megakaryopoiesis, purified CD34+ HSCs from human umbilical cord blood were differentiated into MKs with thrombopoietin (TPO) in the presence of different doses of Ba RNA or HKBA. After 11 days of culture, we determined cell proliferation and the expression of MK differentiation markers (CD41) and MK maturation markers (CD42b) by flow cytometry. Our results demonstrated that Ba RNA significantly reduced the total number of cells in a dose-dependent manner. Furthermore, the highest dose of Ba RNA significantly reduced both the commitment to the megakaryocytic lineage (CD41+/CD42b− cells) and MK maturation (CD41+/CD42b+ cells). HKBA also reduced the total number of cells but did not interfere with megakaryocytic lineage commitment or MK maturation. Overall, our results indicate that both Ba RNA and HKBA inhibit megakaryopoiesis, though at different levels. Ba RNA inhibits HSC proliferation, megakaryocyte commitment, and their maturation, whereas HKBA affects megakaryopoiesis solely by inhibiting HSC proliferation. Next, we evaluated the effects of Ba RNA and HKBA on thrombopoiesis. CD34+ cells were differentiated into MKs with TPO and stimulated on either day 0 or day 11 of culture with different doses of Ba RNA or HKBA. On day 16, platelet production was assessed in both culture conditions. In cells stimulated on day 11, our results showed a trend toward reduced platelet production with Ba RNA and a significant reduction with HKBA. Therefore, Ba RNA and HKBA appear to affect thrombopoiesis after megakaryopoiesis is completed. Finally, we began evaluating the role of RNA-sensing TLRs in Ba RNA-mediated megakaryo/thrombopoiesis modulation. To do this, CD34+ cells were pretreated with TLR7 or TLR7/8 antagonists in the presence of Ba RNA. Preliminary results showed that even in the presence of TLR7 and TLR8 antagonists, Ba RNA was still capable of negatively modulating both megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Future experiments will explore the possible receptors involved in these phenomena. In summary, our results suggest that Ba RNA is a vita-PAMP capable of modulating the establishment of platelet-leukocyte complexes, as well as modulating megakaryopoiesis and platelet biogenesis by interacting with hematopoietic progenitors (CD34+) and MKs in the bone marrow. Furthermore, structural components of Ba may also be involved in these processes. This could, at least in part, explain the thrombocytopenia observed in the chronic phase of the disease.
Citación:
---------- APA ----------
Bueno, Jorgelina. (2025). Modulación de la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria por el ARN de Brucella abortus : su rol en la inmunopatología de la brucelosis humana. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001783_Bueno
---------- CHICAGO ----------
Bueno, Jorgelina. "Modulación de la megacariopoyesis y la biogénesis plaquetaria por el ARN de Brucella abortus : su rol en la inmunopatología de la brucelosis humana". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001783_Bueno
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