Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Modulación de la dinámica estructural y funcional de la proteína mitocondrial humana ISCU2 mediante nanoanticuerpos |
| Título alternativo: | Modulation of the structural and functional dynamics of the human mitochondrial protein ISCU2 using nanoantibodies |
| Autor: | Rodríguez, Naira |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Fecha de defensa: | 2025-03-11 |
| Fecha en portada: | Febrero de 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Santos, Javier |
| Jurado: | Monte, Martín; Rubinstein, Natalia; Berardino, Bruno Gabriel |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001781_Rodriguez |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001781_Rodriguez.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001781_Rodriguez |
| Ubicación: | Dep.BIO 001781 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Rodríguez, Naira. (2025). Modulación de la dinámica estructural y funcional de la proteína mitocondrial humana ISCU2 mediante nanoanticuerpos. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001781_Rodriguez |
Resumen:
La proteína mitocondrial humana ISCU2 forma parte del supercomplejo ISC, el cual es esencial para la biogénesis de centros hierro-azufre (Fe-S). Varias enfermedades poco frecuentes se han asociado con variantes patogénicas de las proteínas y enzimas involucradas en esta vía biosintética. En particular, algunas mutaciones en el gen que codifica ISCU2 se asocian con la Miopatía por deficiencia de ISCU2, una enfermedad caracterizada por alteraciones en la energética celular. El objetivo principal del trabajo es investigar la interacción entre ISCU2 y posibles tutores moleculares. Para ello, se seleccionaron nanoanticuerpos dirigidos contra esta proteína (anti-ISCU2) como andamiaje para dichos tutores moleculares, con el fin de modular su actividad y estabilizar su forma biológicamente activa. Este enfoque busca abrir nuevas vías terapéuticas basadas en la estabilización y el correcto plegamiento de proteínas, con el propósito de mejorar la formación de centros Fe-S y, por ende, mejorar la energética de las células afectadas por la deficiencia de ISCU2. En este trabajo, tres nanoanticuerpos seleccionados por nuestro laboratorio mediante la técnica de display en fagos, fueron evaluados computacionalmente. Como punto de partida, se estudiaron los complejos ISCU2:nanoanticuerpo hallados mediante la aplicación de AlphaFold 2 y se evaluó su conformación en el contexto del supercomplejo de biosíntesis de centros Fe-S. Se decidió estudiar al nanoanticuerpo que, al unirse a ISCU2, mostró menor interferencia en las interacciones de ISCU2 con las demás subunidades del supercomplejo ISC. Este nanoanticuerpo (NB 2A9), al igual que las demás proteínas utilizadas (NFS1/ACP-ISD11, FXN e ISCU2), fue expresado en bacterias para su análisis experimental. El NB 2A9 presentó una elevada resistencia al desplegado por temperatura (Tm = 71.9 oC) que, asimismo, se vio incrementada tras la adición de ISCU2 (Tm = 76.1 oC). La interacción entre ISCU2 y NB 2A9 fue estudiada por ELISA, interferometría de biocapas, dicroísmo circular y cromatografía de exclusión molecular. Además, se analizó el efecto del NB 2A9 sobre la actividad desulfurasa del supercomplejo. La adición del NB 2A9 tuvo un efecto moderadamente inhibitorio, lo que sugiere que la interacción podría derivar en una perturbación de la conformación y/o de la interacción de ISCU2 con el resto de las subunidades del supercomplejo ISC. En este contexto, se realizó una nueva predicción de la estructura de los complejos ISCU2:nanoanticuerpo pero utilizando AlphaFold 3, la nueva versión del predictor. El análisis de los resultados informáticos obtenidos sugirió, en este caso, una conformación del complejo ISCU2:NB_2A9 que resulta incompatible con la formación del supercomplejo ISC. En base a los resultados obtenidos, se propone que el NB 2A9 podría afectar la correcta interacción entre las subunidades del supercomplejo. Esto interferiría con la formación del supercomplejo funcional y, por ende, disminuiría la actividad desulfurasa del mismo.
Abstract:
The human mitochondrial protein ISCU2 is part of the ISC supercomplex, which is essential for the biogenesis of iron-sulfur (Fe-S) clusters. Several rare diseases have been associated with pathogenic variants of the proteins and enzymes involved in this biosynthetic pathway. In particular, some mutations in the gene encoding ISCU2 are associated with ISCU2 Deficiency Myopathy, a disease characterized by alterations in cellular energetics. The main objective of his work is to investigate the interaction between ISCU2 and potential molecular chaperones. To this end, nanobodies directed against this protein (anti-ISCU2) were selected as scaffolds for these molecular chaperones, aiming to modulate its activity and stabilize its biologically active form. This approach seeks to open new therapeutic avenues based on the stabilization and proper folding of proteins, with the goal of improving Fe-S cluster formation and, consequently, enhancing the energetics of cells affected by ISCU2 deficiency. In this study, three nanobodies selected by our laboratory using the phage display technique were computationally evaluated. As a starting point, the ISCU2:nanobody complexes identified were studied through the application of AlphaFold 2, and their conformation was assessed in the context of the Fe-S cluster biosynthesis supercomplex. The nanobody that exhibited the least interference with ISCU2’s interactions with other ISC supercomplex subunits upon binding was chosen for further study. This nanobody (NB 2A9), along with the other proteins used (NFS1/ACP-ISD11, FXN, and ISCU2), was expressed in bacteria for experimental analysis. NB 2A9 demonstrated high resistance to temperature-induced unfolding (Tm = 71.9°C), which further increased upon the addition of ISCU2 (Tm = 76.1°C). The interaction between ISCU2 and NB 2A9 was studied using ELISA, biolayer interferometry, circular dichroism, and size-exclusion chromatography. Additionally, the effect of NB 2A9 on the desulfurase activity of the supercomplex was analyzed. The addition of NB 2A9 had a moderately inhibitory effect, suggesting that the interaction could lead to a perturbation of ISCU2’s conformation and/or its interaction with the other subunits of the ISC supercomplex. In this context, a new prediction of the ISCU2:nanobody complex structure was performed using AlphaFold 3, the latest version of the predictor. The computational analysis of the obtained results suggested a conformation of the ISCU2:NB_2A9 complex that is incompatible with the formation of the ISC supercomplex. Based on the results obtained, it is proposed that NB 2A9 could affect the proper interaction between the subunits of the ISC supercomplex. This would interfere with the formation of the functional supercomplex and, consequently, reduce its desulfurase activity.
Citación:
---------- APA ----------
Rodríguez, Naira. (2025). Modulación de la dinámica estructural y funcional de la proteína mitocondrial humana ISCU2 mediante nanoanticuerpos. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001781_Rodriguez
---------- CHICAGO ----------
Rodríguez, Naira. "Modulación de la dinámica estructural y funcional de la proteína mitocondrial humana ISCU2 mediante nanoanticuerpos". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001781_Rodriguez
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