Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Evaluación de estrategia con proteínas troyanas para la Ataxia de Friedreich utilizando a Dictyostelium discoideum como modelo de estudio |
| Título alternativo: | Evaluation of trojan protein strategy for Friedreich’s Ataxia using Dictyostelium discoideum as a model system |
| Autor: | Crivaro, Nicolás Martín |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - Facultad de Ciencias Exactas - Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular. Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional (IB3)
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| Publicación en la web: | 2025-05-30 |
| Fecha de defensa: | 2024-12-02 |
| Fecha en portada: | 2024 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Gentili, Hernán Gustavo |
| Director Asistente: | Velázquez Duarte, Francisco |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001763_Crivaro |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001763_Crivaro.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001763_Crivaro |
| Ubicación: | Dep.BIO 001763 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Crivaro, Nicolás Martín. (2024). Evaluación de estrategia con proteínas troyanas para la Ataxia de Friedreich utilizando a Dictyostelium discoideum como modelo de estudio. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001763_Crivaro |
Resumen:
Las enfermedades poco frecuentes (EPoF) son aquellas cuya tasa de incidencia es muy baja en la sociedad. Debido a esto, son muy poco conocidas e investigadas, por lo que es de suma importancia poder concientizar y darlas a conocer. De esta manera se podrían obtener más recursos para poder investigarlas y generar nuevos tratamientos, permitiendo que las personas que las padecen puedan mejorar su calidad de vida. A lo largo de esta tesis de licenciatura se trabajó sobre una EPoF en particular denominada Ataxia de Friedreich (AF), una enfermedad neurodegenerativa causada por una alteración en la expresión o en la funcionalidad de la Frataxina (FXN). La deficiencia en FXN lleva a un desbalance en el metabolismo mitocondrial, especialmente en la síntesis de centros ferro sulfurados (Fe-S). Además, existe un incremento de hierro en la mitocondria que da lugar al aumento de especies reactivas del oxígeno, lo que provoca daño celular y disfunción mitocondrial. Las células más afectadas son aquellas que consumen más energía, como las neuronas y los cardiomiocitos, lo que se refleja en trastornos neuromotores y cardíacos asociados a la enfermedad. Para realizar los estudios propuestos hemos utilizado como modelo de estudio al protista ameboide Dictyostelium discoideum, un organismo unicelular de vida libre, haploide, no patógeno que cuenta con un ciclo de vida con varias fases. Las propiedades previamente comentadas sobre D. discoideum, sumadas a la facilidad en la manipulación y el cultivo del mismo, a la disponibilidad del genoma completo secuenciado, a la realización de numerosos trabajos -omicos y a que presenta un alto grado de conservación en la maquinaria celular y molecular con el ser humano, hacen de dicha ameba un excelente organismo modelo de estudio (1–4). En base a descubrimientos hechos en el laboratorio, inicialmente se observó que la FXN de D. discoideum (DdFXN) y la FXN humana (hsFXN) presentan un alto grado de homología, así como también la tienen el resto de las proteínas que integran el súper complejo formador de centros Fe-S de ambas especies (5). También se demostró que la DdFXN es capaz de activar, in vitro, al súper complejo desulfurasa humano. Posteriormente, se produjo una cepa viable de D. discoideum modificada genéticamente mediante la técnica de CRISPR-CAS9 denominada CC8, la cual es deficiente en FXN (6). Estos antecedentes proponen a D. discoideum como un excelente candidato para modelar la AF. Por otro lado, se generó una variante de la hsFXN denominada hsSILCAR, la cual es más estable in vitro (7). También, se diseñó una construcción que contiene la secuencia de la hsSILCAR madura junto a una serie de TAGs, el MTS de la citrato sintasa humana y el péptido de penetración celular TAT, la cual se denominó hsSILCARtry. Las proteínas troyanas son aquellas que contienen un péptido de penetración celular (CPP), el cual les permite atravesar la membrana celular sin mediación de ningún receptor o intermediario, mediante mecanismos de cargas iónicas (8,9). Esto posibilita el delivery de ácidos nucleicos, péptidos o proteínas al interior de las células, siendo un mecanismo no específico que funciona para distintos tipos celulares. En el contexto previamente comentado surge el trabajo realizado en esta tesis de licenciatura, donde nos propusimos evaluar el efecto de hsSILCARtry en la cepa de D. discoideum deficiente en FXN (CC8). Los objetivos que nos propusimos en este trabajo constan de la producción y purificación de hsSILCARtry en su forma monomérica, la evaluación de la internalización celular de hsSILCARtry en Dictyostelium discoideum, la evaluación de la reversión del fenotipo observado en el crecimiento de la cepa CC8 al tratar las amebas con la proteína troyana y por último la visualización de las mitocondrias de las cepas AX2 y CC8 mediante microscopía de fluorescencia. A lo largo del trabajo se logró obtener hsSILCARtry monomérica con un rendimiento de 10,26 mg/litro de cultivo, luego de una ultrafiltración que permitió descartar los agregados solubles multiméricos presentes en la muestra. Previo al tratamiento de las células de D. discoideum con la proteína troyana purificada, se puso a punto la internalización celular de la misma. Como se observó la presencia de actividad proteolítica extracelular de la ameba, el uso de inhibidores de proteasas nos facilitó observar la entrada de hsSILCARtry a las células luego de una incubación de 24 horas. A partir de la comprobación del ingreso de la proteína troyana a las células, se realizaron las curvas de crecimiento donde se evidenció una reversión parcial del crecimiento de la cepa CC8 al ser tratada con hsSILCARtry, así como también se observó un leve aumento del crecimiento de la cepa AX2 respecto a la cepa AX2 sin tratar. En adición, incubaciones de mayor tiempo con inhibidores de proteasas presentaron un efecto deletéreo en el crecimiento de las amebas. Finalmente, en el marco de explorar nuevos enfoques para el uso de D. discoideum como modelo de estudio de la AF se logró visualizar las mitocondrias de la cepa AX2 y la cepa CC8 mediante microscopía confocal de fluorescencia. Se distinguieron diferencias en la morfología, la distribución y la intensidad de fluorescencia de las mitocondrias entre ambas cepas. Todo lo comentado previamente presenta una validación de la ameba D. discoideum como modelo de estudio de la AF, además de ser un potencial sistema para poder modelar otras EPoF.
Abstract:
Rare diseases (RD) are conditions with very low incidence rates in the population. Due to their rarity, they are often under-recognized and under-researched, making it essential to raise awareness and promote their study. This awareness could lead to increased funding for research and the development of new treatments, thereby improving the quality of life for those affected. In this undergraduate thesis, we focused on a specific RD called Friedreich’s Ataxia (FA), a neurodegenerative disease caused by an impairment in the expression or functionality of the protein Frataxin (FXN). FXN deficiency leads to an imbalance in mitochondrial metabolism, particularly affecting the synthesis of iron-sulfur (Fe-S) clusters. Additionally, excess mitochondrial iron accumulation results in elevated reactive oxygen species, causing cellular damage and mitochondrial dysfunction. The cells most affected are those with high energy demand, such as neurons and cardiomyocytes, resulting in neuromotor and cardiac disorders associated with the disease. For the proposed studies, we used the amoeboid protist Dictyostelium discoideum as our model. This free-living, haploid, non-pathogenic, unicellular organism has a life cycle with multiple stages. The characteristics of D. discoideum, combined with its ease of manipulation and culture, availability of a fully sequenced genome, extensive omics studies, and high degree of conservation in cellular and molecular machinery with humans, make it an excellent model organism (1–4). Based on previous findings in the laboratory, it was observed that D. discoideum FXN (DdFXN) and human FXN (hsFXN) share a high degree of homology, as do other proteins in the Fe-S cluster supercomplex across both species (5). Furthermore, DdFXN was shown to activate the human desulfurase supercomplex in vitro. Subsequently, we produced a viable D. discoideum strain genetically modified using CRISPR-CAS9, named CC8, which has a knockout of the FXN gene (6). These findings support D. discoideum as an excellent candidate for modeling FA. Additionally, a variant of hsFXN named hsSILCAR was developed, which is more stable in vitro (7). A construct containing the sequence for mature hsSILCAR, along with a series of tags, the mitochondrial targeting sequence (MTS) of human citrate synthase, and the TAT cell-penetrating peptide, was designed, referred to as hsSILCARtry. Trojan proteins, which include a cell-penetrating peptide (CPP), can cross cellular membranes via ionic mechanisms without receptor mediation (8,9). This enables the delivery of nucleic acids, peptides, or proteins into cells, providing a non-specific mechanism effective for various cell types. This thesis aimed to assess the effect of hsSILCARtry on the FXN-deficient D. discoideum strain CC8. Our objectives included producing and purifying monomeric hsSILCARtry, evaluating its cellular internalization in D. discoideum, assessing the reversal of the growth phenotype in the CC8 strain when treated with the Trojan protein, and visualizing mitochondria in the AX2 and CC8 strains through fluorescence microscopy. During this work, we successfully obtained monomeric hsSILCARtry with a yield of 10,26 mg/liter of culture after ultrafiltration to remove soluble multimeric aggregates. Before treating D. discoideum cells with the purified Trojan protein, we optimized its cellular internalization. Observing extracellular proteolytic activity in the amoeba, we used protease inhibitors, which facilitated the entry of hsSILCARtry into cells after 24 hours of incubation. Upon verifying Trojan protein internalization, growth curves demonstrated a partial reversal of the growth defect in CC8 cells treated with hsSILCARtry, along with a slight increase in growth in the treated AX2 strain compared to untreated AX2 cells. Extended incubation with protease inhibitors showed a deleterious effect on amoeba growth. Finally, in exploring new avenues for using D. discoideum as a model for FA, we successfully visualized mitochondria in the AX2 and CC8 strains using confocal fluorescence microscopy. Differences were observed in mitochondrial morphology, distribution, and fluorescence intensity between the two strains. The findings of this study validate D. discoideum as a model for studying FA and suggest its potential as an effective system for modeling other rare diseases.
Citación:
---------- APA ----------
Crivaro, Nicolás Martín. (2024). Evaluación de estrategia con proteínas troyanas para la Ataxia de Friedreich utilizando a Dictyostelium discoideum como modelo de estudio. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001763_Crivaro
---------- CHICAGO ----------
Crivaro, Nicolás Martín. "Evaluación de estrategia con proteínas troyanas para la Ataxia de Friedreich utilizando a Dictyostelium discoideum como modelo de estudio". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001763_Crivaro
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