Registro:
Documento: | Tesis de Grado |
Título: | Caracterización de una α-L-arabinofuranosidasa de la familia GH51 y su potencial aplicación en la valorización de xilano proveniente de biomasa lignocelulósica |
Título alternativo: | Characterization of an α-L-arabinofuranosidase from the GH51 family and its potential application in the valorization of xylan from lignocellulosic biomass |
Autor: | Leudo Orozco, David |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Lugar de trabajo: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - CONICET. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO)
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Publicación en la web: | 2025-06-12 |
Fecha de defensa: | 2024-06-07 |
Fecha en portada: | 2024 |
Grado Obtenido: | Grado |
Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
Director: | Campos, Eleonora |
Director Asistente: | Ontañon, Ornella Mailén |
Consejero: | Sánchez Miguel, Ignacio Enrique |
Jurado: | Figuerola, Eva Lucía Margarita; Lia, Verónica Viviana; Caramelo, Julio Javier |
Idioma: | Español |
Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco |
Ubicación: | Dep.BIO 001714 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Leudo Orozco, David. (2024). Caracterización de una α-L-arabinofuranosidasa de la familia GH51 y su potencial aplicación en la valorización de xilano proveniente de biomasa lignocelulósica. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco |
Resumen:
La biomasa lignocelulósica está compuesta mayoritariamente por los polisacáridos estructurales celulosa y hemicelulosa. Es considerada una materia prima con gran potencial para la producción de biocombustibles y diversos bioproductos. Sin embargo, su aprovechamiento aun presenta dificultades técnicas dado que se requiere optimizar procesos que permitan mejorar el rendimiento de conversión de polisacáridos a oligosacáridos o a azúcares fermentables. Para abordar eficazmente este problema, es vital estudiar enzimas que actúan sobre los polisacáridos, conocidas como CAZimas, ya que conducirán a la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica. Existen diversas enzimas capaces de degradar la lignocelulosa y son clasificadas en familias según su secuencia aminoacídica y estructura tridimensional. Dentro de esta clasificación, las glicosil hidrolasas (GH) son el grupo mayoritario. Existe una amplia diversidad de microorganismos incluyendo hongos, arqueas y bacterias que son fuentes de enzimas lignocelulolíticas excepcionalmente diversas y multifuncionales. Las bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas y Cellulomonas entre otros, se destacan por su capacidad para hidrolizar polisacáridos de la pared vegetal a través de la secreción de enzimas. En particular, en el Laboratorio de Enzimas Agroindustriales para Bioprocesos se ha estudiado exhaustivamente la cepa Cellulomonas sp. B6, aislada de suelo de bosque nativo que presenta alta actividad xilanolítica extracelular. Además, se han estudiado las enzimas secretadas cuando la bacteria es cultivada utilizando diferentes fuentes de biomasa lignocelulósica y se han producido algunas de estas enzimas de manera recombinante para su caracterización bioquímica. El xilano es la principal hemicelulosa en plantas terrestres. Es un hetero-polisacárido, de composición variable en función de la fuente vegetal de la que proviene. Por lo tanto, su deconstrucción eficiente requiere de la aplicación de múltiples enzimas, no solo activas sobre la cadena principal de xilosas sino también sobre sus sustituciones, que incluyen otros azúcares y ácidos orgánicos. En este trabajo se plantea la hipótesis de que las enzimas de la familia GH51 de Cellulomonas sp. B6, expresadas de forma recombinante, presentan actividad α-L-arabinofuranosidasa sobre arabinoxilanos y/o sobre los arabino-xilooligosacáridos y que actuarán de manera sinérgica con β-1,4-endo-xilanasas para mejorar la deconstrucción de arabinoxilanos. Esta hipótesis se enmarca en el objetivo general de desarrollar bioprocesos enzimáticos para obtener oligosacáridos prebióticos a partir de la fracción de xilano de biomasas lignocelulósicas. Se estudió una α-L-arabinofuranosidasa intracelular de la familia GH51 (CsAbf51A), debido a que pertenece a una familia de enzimas accesorias capaces de hidrolizar las sustituciones de arabinosa de las hemicelulosas y permiten un mejor acceso para otras enzimas con actividad sobre la cadena principal del xilano, como las enzimas β-1,4-endoxilanasas. La secuencia codificante para la enzima CsAbf51A fue amplificada a partir del ADN genómico de Cellulomonas sp. B6 y clonada en el vector de expresión pET28a(+). La enzima fue expresada de manera recombinante en cepas de Escherichia coli y purificada en forma soluble, para su posterior caracterización bioquímica y funcional. CsAbf51A presentó actividad α-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) sobre arabino-xilo- oligosacáridos (AXOS) y, en menor medida, sobre arabinoxilano (AX). Se demostró que CsAbf51A hidroliza las sustituciones de arabinosa que presentan enlaces simples α(1-2) y/o α(1- 3) a las moléculas de xilosa, tanto cuando están presentes en los extremos no reductores como en sustituciones internas de AXOS cortos. Además, la enzima presentó actividad sobre las sustituciones α(1-3) y las arabinosas terminales unidas por enlaces α(1-5) de la cadena principal de arabinano, otro polisacárido de la pared celular vegetal, liberando arabinosa como único producto. Se evaluó la contribución de CsAbf51A a la deconstrucción del xilano en combinación con tres β- 1,4-endoxilanasas (EC 3.2.1.8) de las familias GH10 (CsXyn10A y CsXyn10D) y GH11 (CsXyn11A), previamente obtenidas de manera recombinante y caracterizadas en el grupo de trabajo. Se demostró que CsAbf51A, actúa de manera sinérgica cuando se combina simultáneamente con las GH10, actuando sobre los AXOS producidos por las xilanasas desde AX, lo cual resultó en un incremente de aproximadamente 1,5 veces en la concentración de xilosa liberada por la acción individual de las GH10 y un incremento de 3,5 veces respecto de la concentración de arabinosa liberada por solo la GH51. También, se observó un aumento de XOS cortos con grado de polimerización 2 y 3, además de arabinosa, cuando CsAbf51A se combinó con CsXyn11A. Por otro lado, cuando se aplicó posteriormente a las xilanasas, CsAbf51A fue activa sobre la mayoría de los AXOS generados por dichas enzimas, transformándolos en xilooligosacáridos lineales sin sustituciones (XOS). Esta Tesis permitió caracterizar una nueva enzima codificada en el genoma de Cellulomonas sp. B6, con actividad α-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), incrementando las herramientas y el conocimiento en el desarrollo de bioprocesos enzimáticos potencialmente aplicables en la valorización del xilano de biomasa lignocelulósica residual.
Abstract:
Lignocellulosic biomass is mainly composed of the structural polysaccharides cellulose and hemicellulose. It is considered a raw material with great potential for the production of biofuels and various bioproducts. However, its utilization still presents technical difficulties since it requires optimizing processes to improve the conversion yield of polysaccharides to oligosaccharides or fermentable sugars. To effectively address this problem, studies on enzymes that act on polysaccharides, known as CAZymes, are vital as they will lead to the hydrolysis of lignocellulosic biomass. There are various enzymes capable of degrading lignocellulose and are classified into families based on their amino acid sequence and three-dimensional structure. Within this classification, glycoside hydrolases (GH) are the largest group. There is a wide diversity of microorganisms, including fungi, archaea, and bacteria, that are exceptionally diverse and multifunctional sources of lignocellulolytic enzymes. Bacteria of the genera Bacillus, Pseudomonas, and Cellulomonas, among others, stand out for their ability to hydrolyze polysaccharides from plant cell walls through enzyme secretion. In particular, the Laboratory of Agroindustrial Enzymes for Bioprocesses has extensively studied the strain Cellulomonas sp. B6, isolated from native forest soil, which shows high extracellular xylanolytic activity. Furthermore, enzymes secreted when the bacteria are cultivated using different lignocellulosic biomass sources have been studied, and some of these enzymes have been produced recombinantly for biochemical characterization. Xylan is the main hemicellulose in terrestrial plants. It is a heteropolysaccharide, with a variable composition depending on the plant source it comes from. Therefore, its efficient deconstruction requires the application of multiple enzymes, not only active on the main chain of xyloses but also on their substitutions, including other sugars and organic acids. The hypothesis of this work is that enzymes from the GH51 family of Cellulomonas sp. B6, expressed recombinantly, have α-L-arabinofuranosidase activity on arabinoxylans and/or arabinoxyloligosaccharides and will act synergistically with β-1,4-endo-xylanases to improve the deconstruction of arabinoxylans. This hypothesis is framed within the general objective of developing enzymatic bioprocesses to obtain prebiotic oligosaccharides from the xylan of lignocellulosic biomass. An intracellular α-L-arabinofuranosidase from the GH51 family (CsAbf51A) was studied, as it is part of a family of accessory enzymes capable of hydrolyzing arabinose substitutions of hemicelluloses and allow better access for other enzymes with activity on the main chain of xylan, such as enzymes with β-1,4-endoxylanase activity (EC 3.2.1.8). The coding sequence for the enzyme CsAbf51A was amplified from the genomic DNA of Cellulomonas sp. B6 and cloned into the expression vector pET28a(+). The enzyme was recombinantly expressed in Escherichia coli strains and purified in soluble form for subsequent biochemical and functional characterization. CsAbf51A showed α-L-arabinofuranosidase activity (EC 3.2.1.55) on arabinoxyloligosaccharides (AXOS) and, to a lesser extent, on arabinoxylan (AX). It was demonstrated that CsAbf51A hydrolyzes the arabinose substitutions that have α(1-2) and/or α(1-3) simple bonds to xylose molecules, both when present in non-reducing ends and in internal substitutions of short AXOS. Additionally, CsAbf51A showed activity on the α(1-3) substitutions, and terminal arabinoses linked by α(1-5) bonds of the main chain of arabinan, another polysaccharide of the plant cell wall, releasing arabinose as the only product. The contribution of CsAbf51A to the deconstruction of xylan in combination with three β-1,4- endoxylanases (EC 3.2.1.8) from the GH10 (CsXyn10A and CsXyn10D) and GH11 (CsXyn11A) families, previously obtained recombinantly and characterized in the research group, was evaluated. It was demonstrated that CsAbf51A acts synergistically when simultaneously combined with GH10, acting on the AXOS produced by the xylanases from AX, resulting in an increase of approximately 1.5 times in the concentration of xylose released by the individual action of GH10 and an increase of 3.5 times regarding the concentration of arabinose released by GH51 alone. Additionally, an increase in short XOS with a degree of polymerization of 2 and 3, in addition to arabinose, was observed when CsAbf51A was combined with CsXyn11A. On the other hand, when applied subsequently to the xylanases, CsAbf51A was active on most AXOS generated by these enzymes, transforming them into linear xyloligosaccharides without substitutions (XOS). This thesis allowed characterizing a new enzyme encoded in the genome of Cellulomonas sp. B6, with α-L-arabinofuranosidase activity (EC 3.2.1.55), increasing the tools and knowledge in the development of enzymatic bioprocesses potentially applicable in the valorization of xylan from residual lignocellulosic biomass.
Citación:
---------- APA ----------
Leudo Orozco, David. (2024). Caracterización de una α-L-arabinofuranosidasa de la familia GH51 y su potencial aplicación en la valorización de xilano proveniente de biomasa lignocelulósica. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco
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Leudo Orozco, David. "Caracterización de una α-L-arabinofuranosidasa de la familia GH51 y su potencial aplicación en la valorización de xilano proveniente de biomasa lignocelulósica". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001714_LeudoOrozco
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