Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Desarrollo de una herramienta para el estudio del proceso de reprogramación involucrado en la generación de células madre pluripotentes inducidas |
| Título alternativo: | Development of a tool for studying the reprogramming process involved in the generation of induced pluripotent stem cells3 |
| Autor: | García, Mora Reneé |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
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| Fecha de defensa: | 2024-04-17 |
| Fecha en portada: | Marzo 2024 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Guberman, Alejandra Sonia |
| Director Asistente: | Francia, Marcos Gabriel |
| Jurado: | Cánepa, Eduardo Tomás; Fontana, Vanina Andrea; Durrieu, Lucía |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001704_Garcia |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001704_Garcia.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001704_Garcia |
| Ubicación: | Dep.BIO 001704 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. García, Mora Reneé. (2024). Desarrollo de una herramienta para el estudio del proceso de reprogramación involucrado en la generación de células madre pluripotentes inducidas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001704_Garcia |
Resumen:
Las células madre pluripotentes (CMP) presentan dos características esenciales; en condiciones adecuadas de cultivo pueden auto-renovarse indefinidamente y diferenciarse a tipos celulares derivados de las tres capas germinales. Además de las CMP que existen naturalmente en diferentes estadios embrionarios y que pueden cultivarse in vitro, en la actualidad, es posible generar CMP a partir de células terminalmente diferenciadas, mediante un proceso de reprogramación, que involucra la expresión ectópica de factores de transcripción (FTs) específicos. Estas células son denominadas CMP inducidas (CMPI) y representan una gran promesa con importantes aplicaciones en modelos de enfermedades, estudios de desarrollo, evaluación de fármacos y potenciales tratamientos en el área de la medicina regenerativa. Si bien el área ha experimentado enormes avances, la obtención de CMPI sigue siendo compleja y persisten incógnitas en torno a los mecanismos moleculares implicados, cuyo entendimiento es crucial para la optimización del proceso. Se han evaluado diversas variantes en los métodos de reprogramación; sin embargo, múltiples factores afectan la eficiencia y se consideran barreras o cuellos de botella del proceso. Entre los factores limitantes del proceso se encuentran la incorporación de los FTs de reprogramación en las células diferenciadas y su acceso a regiones compactas de la cromatina. Este trabajo aborda esta limitación mediante el desarrollo de una herramienta que facilita el estudio de los mecanismos moleculares que favorecen la reprogramación celular. Para ello, generamos líneas celulares clonales de fibroblastos conteniendo una construcción inducible para la expresión de los FTs específicos para la reprogramación. Esta estrategia supera la limitación asociada a la introducción simultánea de todos los FTs necesarios en cada célula, mejorando así la eficiencia del proceso y facilitando su estudio y seguimiento en la población celular. En particular, una de las líneas generadas posee, además, otra construcción inducible que codifica para uno de los FT, OCT4, fusionado a la proteína fluorescente YPet, constituyendo una excelente herramienta para el estudio de la dinámica y distribución de este FT durante la reprogramación. Las líneas celulares fueron validadas mediante PCR y Western Blot. A su vez, mediante análisis de un marcador de pluripotencia, la aparición de actividad enzimática de fosfatasa alcalina, analizamos tanto la capacidad de estas células de adquirir este marcador, indicio del proceso de reprogramación, como el efecto de diversas moléculas pequeñas en la eficiencia del proceso. Se ha evidenciado que el agregado de estas moléculas durante la reprogramación tiene un impacto positivo en la eficiencia del proceso, debido a su influencia en la descompactación de la cromatina y en vías de señalización involucradas. De esta forma, logramos abordar dos obstáculos importantes del proceso de reprogramación. La herramienta desarrollada en este trabajo representa un valioso recurso para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación celular, ya que no solo mejora la eficiencia del proceso, sino que además simplifica su estudio y seguimiento. La línea celular conteniendo la construcción de YPet-OCT4 amplía aún más la utilidad de esta herramienta al permitir un análisis detallado en células vivas de la dinámica y distribución del FT durante el proceso de reprogramación. Una comprensión profunda de los mecanismos moleculares implicados contribuirá al conocimiento de procesos fundamentales y es esencial para futuras mejoras y avances en el campo de la reprogramación celular.
Abstract:
Pluripotent stem cells (PSCs) exhibit two essential characteristics; they can self-renewal indefinitely under specific culture conditions and differentiate into all cell types derived from the three germ layers. In addition to PSCs that naturally exist in different embryonic stages and can be cultured in vitro, nowadays it is possible to generate PSCs from terminally differentiated cells through a reprogramming process, which involves the ectopic expression of specific transcription factors (TFs). These cells, denominated induced PSCs (iPSCs), represent a great promise with important applications in disease modeling, development studies, drug evaluation and potential treatments in regenerative medicine. Despite significant advances in the field, iPSCs generation is still complex, the molecular mechanisms involved are not fully understood, and their understanding is crucial for optimizing the process. Several reprogramming methods have been evaluated, but there are multiple factors that affect their efficiency and are considered barriers or bottlenecks of the process. These include the incorporation of the reprogramming TFs into the differentiated cells and their access to compact chromatin regions. This project addresses this limitation by developing a tool that facilitates the study of the molecular mechanisms, favoring cell reprogramming. To do so, we generated clonal fibroblasts cell lines containing an inducible construct for the expression of the specific reprogramming TFs. This strategy overcomes the limitation associated with the simultaneous introduction of all the necessary TFs into each cell, thereby improving the efficiency of the process and facilitating the study of the reprogramming cell population. One of the generated cell lines has also another inducible construct of the TF OCT4 fused to the fluorescent protein YPet, providing an excellent tool for studying the dynamics and distribution of this TF during the reprogramming process. The cell lines were validated through PCR and Western Blot. Additionally, by analyzing a marker of pluripotency, the appearance of alkaline phosphatase enzymatic activity, we studied both the capacity of these cells to acquire this marker, an indication of the reprogramming process, and the effect of various small molecules on its efficiency. These molecules, included during the reprogramming process, have a positive impact on its efficiency, due to their influence on chromatin decompaction and on the implicated signaling pathways. Therefore, we address two important obstacles of the reprogramming process. The tool developed in this work represents a valuable resource for studying the molecular mechanisms involved in cellular reprogramming, since it not only improves the efficiency of the process, but also simplifies its study and monitoring. The cell line that includes OCT4 fused to a fluorescent protein enhances the utility of this tool as it allows a detailed analysis of the dynamics and distribution of the TF during the reprogramming process. A deeper comprehension of the molecular mechanisms involved contributes to fundamental knowledge and it’s essential for future improvements and advances in the field.
Citación:
---------- APA ----------
García, Mora Reneé. (2024). Desarrollo de una herramienta para el estudio del proceso de reprogramación involucrado en la generación de células madre pluripotentes inducidas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001704_Garcia
---------- CHICAGO ----------
García, Mora Reneé. "Desarrollo de una herramienta para el estudio del proceso de reprogramación involucrado en la generación de células madre pluripotentes inducidas". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001704_Garcia
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