Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Expresión recombinante de la glicoproteína del virus rábico en un sistema de células eucariotas |
| Título alternativo: | Recombinant expression of the rabies virus glycoprotein in eukaryotic cell system |
| Autor: | Giordano Mendoza, Aylén Rocío |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas
|
| Fecha de defensa: | 2024-04-05 |
| Fecha en portada: | Marzo 2024 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Del Médico Zajac, María Paula |
| Jurado: | Lucero, María Soledad; Mon, María Laura; Peralta, Andrea Verónica |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza |
| Ubicación: | Dep.BIO 001698 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Giordano Mendoza, Aylén Rocío. (2024). Expresión recombinante de la glicoproteína del virus rábico en un sistema de células eucariotas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza |
Resumen:
La rabia es una enfermedad zoonótica, causada por el virus rábico (RABV) y prevenible por vacunación que debe abordarse desde el concepto de “Una Salud”. Esta enfermedad representa un riesgo mundial para la salud pública por su trascendencia, gravedad e impacto social, ya que conduce inevitablemente a la muerte de las personas expuestas al virus cuando no reciben, de forma oportuna, un tratamiento adecuado. Para el control de la rabia existen vacunas convencionales basadas en RABV atenuado o inactivado, siendo éstas últimas ampliamente utilizadas en humanos, animales de compañía y de producción. Además, se han desarrollado numerosas vacunas recombinantes diseñadas racionalmente para expresar la glicoproteína del RABV que contiene epítopes reconocidos por las células T CD4+ y CD8+, y es el principal antígeno inductor de anticuerpos seroneutralizantes. Este tipo de vacunas incluyen: vectores virales, plásmidos bacterianos (vacunas génicas) y subunidades proteicas simples o complejas (producidas en el sistema baculovirus-células de insecto, plantas y células de mamíferos). En nuestro laboratorio desarrollamos vacunas antirrábicas basadas en los vectores virales no replicativos en mamíferos como el poxvirus de canario (CNPV), el virus vaccinia Ankara modificado (MVA) y el adenovirus humano tipo 5 ΔE (Ad-5ΔE), que expresan la glicoproteína. La efectividad de una vacuna frente a la infección con RABV está asociada con altos niveles de anticuerpos neutralizantes. Para detectarlos, en nuestro país, solo se realiza el ensayo de seroneutralización in vivo, en el cual se utiliza un gran número de animales. Si bien existen ELISA que determinan la presencia y niveles de anticuerpos antirrábicos, éstos son importados, aumentando mucho el costo de las determinaciones. Nuestro grupo de trabajo desarrolló un ELISA in house utilizando RABV inactivado y purificado como antígeno, pero observamos gran variabilidad en el rendimiento de las purificaciones de antígeno al utilizar distintos batchs de RABV inactivado. Con el fin de desarrollar un ELISA que permita reemplazar importaciones y que no dependa de la producción de grandes cantidades de virus rábico, nos proponemos expresar la glicoproteína del RABV en células eucariotas y utilizarla como antígeno de tapizado de un ELISA que detecte anticuerpos antirrábicos. En este contexto, el objetivo de esta Tesis de Licenciatura fue expresar y purificar el ectodominio de la glicoproteína del virus rábico a partir de células eucariotas HEK293T. Para ello, se seleccionó el vector de expresión eucariota pSecTag2 (pST) que aporta en el extremo N-terminal la secuencia líder de la cadena de Igκ murina para la secreción de proteínas y en el extremo C-terminal la secuencia del epítope c-myc y seis residuos de histidina en tándem (6xHis) para su detección y purificación. Además, se utilizaron las células HEK293T ya que presentan alta tasa de transfección y son ampliamente utilizadas para la producción de proteínas. En primer lugar, se amplificó la secuencia del ectodominio de la glicoproteína del RABV (RGe) por PCR utilizando oligonucleótidos específicos, se clonó en el vector TOPO-TA y posteriormente en el vector pSecTag2-B. Se obtuvo el vector pST-RGe y se confirmó su identidad nucleotídica mediante secuenciación. Posteriormente, se realizaron ensayos de transfección transitoria de células HEK293T y se detectó la proteína RGe utilizando un anticuerpo anti c-myc en la fracción intracelular (pellet) a las 24, 48 y 72 h post transfección. Basados en el diseño experimental, se esperaba detectar la proteína recombinante en el sobrenadante de las células transfectadas, sin embargo, en las condiciones ensayadas en este trabajo la proteína no se secreta o lo hace en niveles no detectables por las técnicas utilizadas. Finalmente, se determinó que la proteína recombinante puede extraerse del pellet en condiciones nativas. En conclusión, se expresó el ectodominio de la glicoproteína del RABV en la fracción celular de las células HEK293T y se extrajo en condiciones nativas. Dado que el nivel de glicosilación y la estructura de la proteína son fundamentales para el reconocimiento de la misma por los anticuerpos inducidos por la vacunación, consideramos que la RGe obtenida en este trabajo será una herramienta muy útil para desarrollar un ELISA para la detección de anticuerpos antirrábicos.
Abstract:
The concept of rabies as a zoonotic disease, caused by the rabies virus (RABV), and preventable through vaccination, necessitates an approach grounded in the framework of "One Health." This malady poses a global risk to public health due to its significance, severity, and social impact, invariably leading to the demise of individuals exposed to the virus in the absence of timely and appropriate treatment. In the field of rabies control, conventional vaccines based on attenuated or inactivated RABV are prevalent, with the latter widely employed in humans, companion animals, and livestock. Furthermore, numerous rationally designed recombinant vaccines have emerged expressing the RABV glycoprotein that contains epitopes recognized by CD4+ and CD8+ T cells, serving as the primary antigen for seroneutralizing antibodies induction. These vaccines encompass various forms, including viral vectors, bacterial plasmids (gene vaccines), and simple or complex protein subunits (produced in baculovirus-insect cell systems, plants, and mammalian cells). In our laboratory, we have developed rabies vaccines based on viral vectors non-replicative in mammals such as canarypox virus (CNPV), modified vaccinia Ankara virus (MVA), and human adenovirus type 5 ΔE (Ad-5ΔE), all expressing the glycoprotein. The efficacy of a vaccine against RABV infection is associated with high levels of neutralizing antibodies. In our country, the detection of these antibodies relies solely on in vivo seroneutralization assays, necessitating a large number of animals. Although ELISA assays exist for determining the presence and levels of rabies antibodies, these are imported, significantly increasing the cost of assessments. Our research group has developed an in-house ELISA using inactivated and purified RABV as an antigen; however, we observed considerable variability in antigen purification yields within different RABV batches. With the aim of developing an ELISA that replace imports and circumvent the need for large-scale rabies virus production, we propose expressing the RABV glycoprotein in eukaryotic cells and utilizing it as an antigen for coating ELISA plates to detect rabies antibodies. In this context, the aim of this Bachelor's Thesis was to express the ectodomain of rabies virus glycoprotein in HEK293T eukaryotic cells. To achieve this, we selected the eukaryotic expression vector pSecTag2 (pST), which provides the murine Igκ chain leader sequence at the N-terminal end for protein secretion and a c-myc epitope and six tandem histidine residues (6xHis) at the C-terminal end for detection and purification. Additionally, HEK293T cells were chosen for their high transfection efficiency and widespread use in protein production. Initially, the ectodomain sequence of the RABV glycoprotein (RGe) was amplified by PCR using specific primers, cloned into the TOPO-TA vector, and subsequently into the pSecTag2-B vector. The sequence identity of the resulting vector, pST-RGe, was confirmed through nucleotide sequencing. Subsequent transient transfection assays of HEK293T cells revealed RGe protein detection in the intracellular fraction (pellet) at 24, 48, and 72 h post-transfection using an anti-c-myc antibody. According to the experimental design, the recombinant protein was expected to be detected in the supernatant of transfected cells; however, under the conditions tested in this study, the protein either failed to be secreted or did so at levels undetectable by the employed techniques. Finally, it was determined that the recombinant protein could be extracted from the pellet under native conditions. In conclusion, the ectodomain of the RABV glycoprotein was expressed in the cellular fraction of HEK293T cells and extracted under native conditions. Considering the critical role of glycosylation level and protein structure in antibody recognition induced by vaccination, we anticipate that the RGe obtained in this study will serve as a valuable tool for developing an ELISA for rabies antibody detection.
Citación:
---------- APA ----------
Giordano Mendoza, Aylén Rocío. (2024). Expresión recombinante de la glicoproteína del virus rábico en un sistema de células eucariotas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza
---------- CHICAGO ----------
Giordano Mendoza, Aylén Rocío. "Expresión recombinante de la glicoproteína del virus rábico en un sistema de células eucariotas". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001698_GiordanoMendoza
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