Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Evaluación de herramientas genéticas disponibles para el knock-down del gen Trl en sistema nervioso central y disco imaginal de ala de larva de Drosophila melanogaster |
| Autor: | Portnoy, Nicolás Ezequiel |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
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| Fecha de defensa: | 2023-03-28 |
| Fecha en portada: | Marzo, 2023 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Frankel, Nicolás |
| Director Asistente: | Mayansky, Ignacio |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001687_Portnoy |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001687_Portnoy.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001687_Portnoy |
| Ubicación: | Dep.BIO 001687 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Portnoy, Nicolás Ezequiel. (2023). Evaluación de herramientas genéticas disponibles para el knock-down del gen Trl en sistema nervioso central y disco imaginal de ala de larva de Drosophila melanogaster. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001687_Portnoy |
Resumen:
Los enhancers son elementos regulatorios del genoma no codificante que controlan la expresión espacio-temporal de uno o más genes. Históricamente, se ha postulado que los enhancers tienen actividad estrictamente contexto-específica (que regulan la expresión de su gen blanco en una única ventana espacio-temporal del desarrollo, un único contexto). Sin embargo, durante los últimos años numerosos estudios de nuestro grupo de y de otros laboratorios han reportado casos de enhancers pleiotrópicos (enhancers activos en más de un contexto espacio-temporal). Estos casos y otros análisis sugieren que una proporción grande de los enhancers de genomas animales son pleiotrópicos. Se sabe que los enhancers activos tienen la cromatina “abierta” (libre de nucleosomas). Un mecanismo que genera regiones de cromatina abierta involucra a factores de transcripción (FTs) “pioneros”, los cuales pueden unirse al DNA cromatinizado y aumentar la accesibilidad de la región. En nuestro grupo, a través de análisis bioinformáticos, encontramos una posible relación entre la función del FT pionero GAF (codificado por el gen Trl) y la activación de enhancers pleiotrópicos en D. melanogaster. Pensamos que la unión de GAF a enhancers pleiotrópicos podría ser necesaria para su activación en distintos contextos. Nuestro objetivo a largo plazo es determinar si la función de GAF es necesaria para activar enhancers pleiotrópicos en sistema nervioso central (SNC) y disco imaginal de ala de larva. Para lograr este objetivo planeamos modificar los niveles de GAF en SNC y disco de ala, para luego evaluar si la disminución de los niveles de este FT afecta la activación de enhancers en ambos contextos. Esta tesina de licenciatura tuvo como objetivo encontrar una herramienta genética para generar un knock-down de Trl en SNC y disco de ala de larva. Primeramente, confirmamos el patrón de expresión de GAF en SNC y disco imaginal de ala de larva. Conociendo las células en las que se expresa GAF en estos contextos, analizamos líneas driver GAL4 que dirigen la expresión en esas células. A diferencia de SNC, en disco de ala no encontramos un único driver que dirija la expresión en todas las células donde se expresa GAF. A partir de los drivers seleccionados (y con un transgén UAS-shRNA) intentamos generar un knock-down de Trl en SNC y en una región del disco de ala mediante RNA interferencia (RNAi). Medimos la eficiencia del knock-down a través de ensayos de inmunofluorescencia y PCR en tiempo real. Encontramos que el RNAi con una copia del driver y el transgén UAS genera una disminución de los niveles de GAF de aproximadamente un 30-35%, en promedio, en ambos contextos. Buscando producir un knock-down de Trl más eficiente, generamos moscas que tuvieran en homocigosis las construcciones GAL4 y UAS (genotipo “doble homocigota”). Individuos dobles homocigotas presentaron fenotipos comportamentales, baja viabilidad y esterilidad. En paralelo, evaluamos la mutación del gen Trl en SNC por CRISPR. Observamos que moscas CRISPR contra Trl en SNC tienen un fenotipo comportamental similar a moscas dobles homocigotas y también presentan esterilidad. Mediante dos estrategias genéticas (RNAi y CRISPR) que afectan a Trl/GAF a diferente nivel (DNA o mRNA) encontramos efectos fenotípicos similares. En conjunto, estos resultados sugieren que podemos silenciar al gen Trl y que la función de GAF sería vital para el funcionamiento del SNC de la mosca.
Abstract:
Transcriptional enhancers cis-regulatory elements that determine spatio-temporal patterns of gene expression. The current paradigm in the field of gene regulation postulates that enhancers drive gene expression in a single window of time and space. However, in the last years the work of our laboratory and other laboratories demonstrated that enhancers can be pleiotropic (enhancers can be active in more than one spatio-temporal context). Furthermore, our data suggest that a large proportion of enhancers in animal genomes are pleiotropic. Active enhancers are DNA regions with “open chromatin” (nucleosome-free regions). A known mechanism for generating nucleosome-free regions involves a class of transcription factors (TF) known as “pioneers”, which can bind to chromatinized DNA and promote local accessibility. Through bioinformatic analysis, in our lab we found a potential relationship between the function of the pioneer TF GAF and the activation of pleiotropic enhancers in D. melanogaster. We hypothesize that the binding of GAF to pleiotropic enhancers may be necessary for their activation in different developmental contexts. Our long term goal is to determine whether GAF's function is necessary to activate pleiotropic enhancers in the central nervous system (CNS) and wing imaginal disc of larvae. To pursue this goal, we plan on modifying the level of GAF in CNS and wing disc, and then analyze whether the knock-down of Trl (GAF's gene) influences the activation of pleiotropic enhancers in both contexts. Thus, the objective of this thesis is to find a reliable genetic tool for knocking-down Trl in both contexts. As a first step, we confirmed the expression pattern of GAF in CNS and wing disc. Then, we looked for GAL4 drivers that generate expression in the cells that express GAF in these contexts. For the wing disc, we didn't find a single driver that drove expression in all the cells that express GAF. However, for the CNS we did find a driver that covers almost all of the expression in this context. Using the selected drivers (and UAS-shRNA transgenes against Trl) we attempted to knock-down Trl in CNS and wing pouch through RNA interference (RNAi). We measured the efficiency of the knock-down through immunofluorescence and real time PCR. We observed that one copy of the driver and one copy of the UAS transgene generate a decrease of about 30-35% of GAF's levels, on average, in both contexts. Pursuing a more efficient knock-down of Trl, we generated flies that carry two copies of the GAL4 and UAS transgenes (“double homozygous” genotype). Double homozygous flies showed comportamental phenotypes, low viability and sterility. In parallel, we analyzed the effect of mutating Trl through CRISPR in the CNS. We found that CRISPR flies against Trl in CNS had comportamental phenotypes similar to those of double homozygous flies. In addition, we discovered that these flies are steriles. Thus, using two genetic strategies (RNAi and CRISPR) that affect Trl/GAF at different levels (DNA or mRNA) we found similar phenotypic effects. Taken together, these results suggest that we were able to silence GAF, and that the role of GAF may be vital for the correct function of the fly's CNS.
Citación:
---------- APA ----------
Portnoy, Nicolás Ezequiel. (2023). Evaluación de herramientas genéticas disponibles para el knock-down del gen Trl en sistema nervioso central y disco imaginal de ala de larva de Drosophila melanogaster. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001687_Portnoy
---------- CHICAGO ----------
Portnoy, Nicolás Ezequiel. "Evaluación de herramientas genéticas disponibles para el knock-down del gen Trl en sistema nervioso central y disco imaginal de ala de larva de Drosophila melanogaster". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001687_Portnoy
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