Resumen:
En este trabajo se emplea como estrategia para establecer posibles reguladores o proteínas blanco de MAPKs recientemente descubiertas, un sistema de doble híbrido. Este sistema permite rastrear en una librería de ADN copia, proteínas que interaccionan físicamente con otra usada como carnada, en este caso, Erk6. El método de doble híbrido tradicional, se basa en una lectura transcripcional de un gen reportero, ya que las dos proteínas híbridas recomponen un factor de transcripción, reconstituyendo una función que, por sí sola, no pueden cumplir ninguna de ellas. Dado que, en este caso, las proteínas en estudio son potencialmente factores de transcripción o sus reguladores en forma directa, existe el riesgo de que una sola de las fusiones reconstituya la funcionalidad y así el reporter se active independientemente de la tracción entre las quimeras. Para evitar este problema, utilizamos una variante del sistema de doble híbrido que no requiere la reconstitución de la actividad de un factor de transcripción. Este método nuevo se basa en revertir el fenotipo de la cepa de levaduras Cdc25-2, que posee una versión mutante de la proteína intercambiadora de GTP de RAS, Cdc25, la cual al volverse inactiva a 37°C, impide el crecimiento. El intercambiador de GTP de RAS humano, hSos es capaz de complementar la mutación en Cdc25 cuando está asociado a la membrana plasmática. Es por eso que, si se fusiona una proteína "carnada" o "bait" (Erk6) a hSos y una library de cDNA a una señal de miristoilación, existe la potencialidad de que se forme un complejo, que localize a hSos en la membrana de la célula. Dicho complejo podría revertir la falta de crecimiento a 37°C y es dependiente de que la proteína codificada por el cDNA sea capaz de interaccionar físicamente con la bait. Este sistema se conoce como SRS (Sos Recruitment System o Sistema de Reclutamiento de Sos). Utilizando este sistema hemos podido clonar varias proteínas capaces de interaccionar con Erk 6 entre las cuales hay: un potencial componente de la familia de factores de transcripción AP-1, una proteína de unión al RNA, que podría estar implicada en el proceso de transcripción a varios niveles, la subunidad alfa de la PKA y una proteína que presenta homologías con un intercambiador de GTP, entre otras.
Citación:
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Coluccio Leskow, Federico. (2000). Identificación de proteínas asociadas a MAPKs mediante un novedoso sistema de doble híbrido. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000722_ColuccioLeskow
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Coluccio Leskow, Federico. "Identificación de proteínas asociadas a MAPKs mediante un novedoso sistema de doble híbrido". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2000.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000722_ColuccioLeskow
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