Resumen:
1 ) Estudios realizados previamente en el laboratorio del Dr. Uchitel habían observado la presencia de un componente tipo L en la corriente de calcio presináptica de los terminales neuromusculares (MNT) del músculo Levator Auris del ratón adulto incubados con el quelante de calcio BAPTA-AM. También se observó que este componente no estaba involucrado en la liberación de neurotransmisor ya que el contenido cuántico, en las mismas condiciones experimentales, no resultó ser sensible a nitrendipina. El objetivo de este trabajo es estudiar el acoplamiento a la liberación de neurotransmisor del canal de calcio voltaje dependiente (CCVD) tipo L de las terminales neuromusculares incubadas con BAPTA-AM por efecto de inhibición de proteín (serin/treonin y tirosin) fosfatasas. 2) Se estudiaron los efectos de los inhibidores de fosfatasas ácido ocadaico (OA) y pervanadato sobre el contenido cuántico de la liberación de neurotransmisor en condiciones en las que los CCVD tipo P/Q estaban bloqueados completamente por acción de ω-agatoxina IVA o ω-agatoxina TK. Luego de la incubación con OA (1 μM) se observó un aumento en el contenido cuántico en las terminales de preparaciones incubadas con BAPTA-AM (más de 400% de incremento, P<0.001) y ningún cambio en dicho parámetro en las preparaciones incubadas con EGTA-AM o DMSO. Asimismo, el pervanadato (0.1 mM) no alteró el valor de QC en ningún caso. Además el aumento inducido por OA fue prevenido (97% de reducción) por incubación con bloqueantes del CCVD tipo L como ser nitrendipina (1 OμM , P< 0.001) o calciseptina (300 nM, P<0.001 ). 3) Se estudió la latencia de los potenciales postsinápticos de placa evocados (End Plate Potential: EPPs) en los casos en los que sólo el CCVD tipo L (usando 120nM ω-aga ) o sólo el CCVD tipo P/Q (usando 40 nM ω-aga y 300 nM calciseptine) estaban disponibles para mediar la entrada de calcio que dispara la liberación de neurotransmisor. El valor medio de latencia para el CCVD tipo P/Q estaba en el rango de 1. 7 a 1.9 ms. Para el CCVD tipo L el valor correspondiente estaba entre 1.9 y 2.5 ms. Además los histogramas de distribución de los valores de latencia del EPP para la liberación estudiada en uno u otro caso mostraron que la distribución para el CCVD tipo L era más dispersa que la correspondiente valor para los CCVD tipo P/Q. Paralelamente, el valor de tiempo de subida de estos EPPs resultó ser significativamente mayor para los CCVD tipo L. 4) Se estudió también el efecto de OA (1μM) y pervanadato (0.1 mM) sobre la liberación espontánea de neurotransmisor. La frecuencia de potenciales de placa miniatura (MEPPs) espontáneos se incrementó por efecto de la incubación con OA sólo en las MNT correspondientes a terminales incubadas con BAPTA-AM (más de 700% de incremento; P< 0.001 ). Además, este incremento fue prevenido por preincubación con nitrendipina (1 OμM, P< 0.001 ) o calciseptina (300 nM, P<0.001 ). Más aún, bloqueantes específicas de CCVD tipo P/Q (ω-aga, 120 nM) o tipo N (ω-conotoxina GVIA, 1 μM) no afectaron dicho incremento. 5) También se estudió la relación entre QC y [Ca2+]0 en las MNT de preparaciones incubadas con BAPTA-AM en condiciones en las que sólo el CCVD tipo P/Q estaba disponible para la liberación de neurotransmisor (condición descripta anteriormente). En esta condición el valor de QC se incrementó a medida que aumentaba la [Ca2+]0 en el rango entre 0.5mM y 2mM. Paralelamente, en condiciones en las que sólo el CCVD tipo L estaba disponible para la liberación de neurotransmisor (condición descripta anteriormente}, el valor de QC aumentó en el rango de valores de [Ca2++]0 entre 0.5mM y 1 mM, pero se redujo significativamente para valores mayores de [Ca2++]0(P< 0.005). Los valores de pendiente del ajuste lineal a la relación planteada en ambos casos fueron de 0.7 y 1.4 para la liberación mediada por CCVD tipo P/Q y L respectivamente. 6) La aplicación de OA (1 μM) no produjo cambio alguno en las corrientes perineurales de calcio (lCa) en las MNT de preparaciones incubadas con BAPTA-AM. Sin embargo, en presencia de OA, la calciseptina pudo reducir dicha corriente (70% de bloqueo) sin alterar la corriente de sodio (INa). 7) La preincubación con H-7 (100μM), inhibidor de proteín kinasas tipo C (PKC) y de proteín kinasas dependiente de cAMP (PKA), pudo prevenir el aumento inducido por OA tanto en QC como en la frecuencia de MEPPs espontáneos descriptos anteriormente, sugiriendo la participación de estas kinasas en el proceso de acoplamiento de CCVD tipo L con la liberación de neurotransmisor 8) En resumen, este trabajo muestra el acoplamiento de el CCVD tipo L con la liberación de neurotransmisor cuando las proteín fosfatasas son inhibidas y en condiciones en las que el calcio intracelular se halla quelado por efecto del quelante rápido de calcio BAPTA.
Citación:
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Depetris, Rafael Salvador. (1999). Acoplamiento del canal de calcio voltaje dependiente tipo L a la liberación de neurotransmisor. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000719_Depetris
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Depetris, Rafael Salvador. "Acoplamiento del canal de calcio voltaje dependiente tipo L a la liberación de neurotransmisor". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000719_Depetris
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