Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Análisis por microscopía de súper-resolución de los cambios en el flagelo espermático murino durante la fusión con el ovocito |
| Título alternativo: | Super-resolution microscopy analysis of changes in the murine sperm flagellum during fusion with the oocyte |
| Autor: | Jabloñski, Martina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Fundación del Instituto de Biología y Medicina Experimental - CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
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| Fecha de defensa: | 2023-03-14 |
| Fecha en portada: | 2023 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Buffone, Mariano Gabriel |
| Consejero: | Calvo, Juan Carlos |
| Jurado: | Cohen, Débora Juana; Vissio, Paula Gabriela; Belmonte, Silvia |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | CAPACITACION ; EXOCITOSIS ACROSOMAL (EA) ; FLAGELO; FUSION DE LAS GAMETASCAPACITATION; ACROSOMAL EXOCYTOSIS (AE); FLAGELLUM ; GAMETE FUSION |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7286_Jablonski |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7286_Jablonski.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7286_Jablonski |
| Ubicación: | BIO 007286 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Jabloñski, Martina. (2023). Análisis por microscopía de súper-resolución de los cambios en el flagelo espermático murino durante la fusión con el ovocito. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7286_Jablonski |
Resumen:
Las cilias y los flagelos son estructuras celulares altamente conservadas presentes en la mayoría de los animales, así como en muchas plantas y protozoos eucariotas. El flagelo puede funcionar como una hélice oscilante autónoma en presencia de adenosín trifosfato (ATP) y un entorno iónico apropiado. En el caso de los espermatozoides de mamífero, para llegar al sitio de fecundación, utilizan el flagelo para desplazarse dentro del aparato reproductor femenino. Este transporte ocurre en el oviducto femenino concomitantemente con un proceso llamado capacitación, donde los espermatozoides atraviesan una serie compleja de cambios bioquímicos y celulares para adquirir la capacidad de fecundar. La capacitación permite que los espermatozoides desarrollen dos eventos celulares esenciales: uno es la adquisición de la movilidad hiperactivada y el otro es la capacidad de realizar la exocitosis acrosomal (EA; también conocida como reacción acrosomal) en respuesta a estímulos específicos. Aunque la EA es esencial para la fecundación, poco se sabe de los espermatozoides que pierden el acrosoma. Esto es particularmente importante in vivo, ya que los espermatozoides luego de la EA aún necesitan realizar procesos importantes como la migración a la ampulla, la localización de los ovocitos no fecundados, la penetración de la matriz del cumulus y la zona pellucida (ZP) y, finalmente, la fusión con el ovocito. Por lo tanto, es fundamental estudiar este subconjunto de gametas. En este trabajo investigamos los cambios celulares y moleculares que ocurren en el flagelo del espermatozoide murino después del inicio de la EA, momento a partir del cual están listos para fecundar al ovocito. Para esto, realizamos ensayos de célula única combinado con microscopía de fluorescencia para estudiar, en principio, el patrón de movimiento de las células que perdieron el acrosoma. Utilizando el ratón transgénico que expresa EGFP en el acrosoma combinado con otro marcador de la EA como es la sonda de membrana FM4-64 se pudo ver que la mayoría de las células reaccionadas pierden movilidad. Sorprendentemente, este grupo de células presentan alta fluorescencia de FM4-64 en la pieza media. Para estudiar este fenómeno en más detalle, se procedió a emplear técnicas y algoritmos de súper-resolución. Entre ellos, se utilizaron Fluctuaciones Radiales de Súper-resolución (Super- Resolution Radial Fluctuations, SRRF) y Súper-Resolución de la Media Desplazada (Mean Shift Super-Resolution, MSSR). Gracias a estas tecnologías, encontramos que este cambio de fluorescencia de FM4-64 está asociado a una disminución en el diámetro de la pieza media del espermatozoide. Muchos reportes previos han mostrado que la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]i) juega un rol fundamental en la EA en ratón. Específicamente, se observó que hay un aumento transitorio de la [Ca2+]i en la cabeza y luego este ion se trasporta a la pieza media. Es por ello, que realizamos experimentos de célula única utilizando la sonda Fluo4 (marcador de la [Ca2+]i) junto con FM4-64 para ver si el aumento de la [Ca2+]i es coincidente con la contracción de la pieza media. Luego de la inducción con progesterona, se vio que la mayoría de las células presentan un aumento transitorio de la [Ca2+]i en la pieza media, que ocurre previo a la contracción del flagelo. Por otra parte, se estudió la relación entre la contracción y la doble hélice de actina que acompaña a las mitocondrias en la pieza media. Para esto, por un lado, se realizaron experimentos de célula única con FM4-64 y una sonda que se une a actina polimerizada, SiR-actin. Estos resultados demuestran que a medida que la pieza media se contrae, la doble hélice de actina y la membrana se acercan ya que aumenta la colocalización de ambas sondas. Por otro lado, también se emplearon otras técnicas de súper-resolución en espermatozoides fijados como la Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM) para ver en detalle la estructura de dicha doble hélice de actina. Se encontró que, con la EA, la doble hélice cambia su estructura tanto en el radio como en la periodicidad de las vueltas. Por último, para estudiar estos cambios estructurales de la pieza media en un ensayo funcional, se hicieron experimentos con ovocitos de fecundación in vitro y de fusión de las gametas en tiempo real. Como resultado, se observó que la pieza media del espermatozoide murino presenta una disminución en la [Ca2+]i seguido de la contracción a medida que progresa la fusión con el ovocito. En conclusión, los resultados de esta tesis demuestran que la pieza media del flagelo murino atraviesa cambios estructurales y dinámicos durante la fusión con el ovocito que pueden ser esenciales para que el flagelo detenga su movilidad y se fusione correctamente con la gameta femenina.
Abstract:
Cilia and flagella are highly conserved cellular structures present in most animals, as well as in plants and eukaryotic protozoa. The flagellum can function as an autonomous oscillating helix in the presence of adenosine triphosphate (ATP) and an appropriate ionic environment. In the case of mammalian sperm, to reach the site of fertilization, they use the flagellum to swim within the female reproductive tract. This transport occurs in the female oviduct concomitantly with a process called capacitation, where sperm go through a complex series of biochemical and cellular changes to acquire the ability to fertilize. Capacitation allows sperm to perform two essential cellular events: one is the acquisition of hyperactivated motility and the other is the ability to undergo acrosomal exocytosis (AE; also known as acrosomal reaction) in response to specific stimuli. Although AE is essential for fertilization, little is known about sperm that lose the acrosome. This is particularly important in vivo, after AE, as sperm still need to perform important processes such as migration to the ampulla, localization of unfertilized eggs, penetration of the cumulus matrix and zona pellucida, and finally, fusion with the oocyte. Therefore, it is essential to study this subset of gametes. In this work we investigate the cellular and molecular changes that occur in the sperm flagellum after the onset of AE, when the sperm are ready to fertilize the oocyte. For this, we performed single cell experiments combined with fluorescence microscopy to study, first, the motility pattern of the acrosome-reacted cells. Using the transgenic mouse that expresses EGFP in the acrosome combined with another AE marker such as the membrane probe FM4-64, it was noticed that most of the acrosome-reacted cells lose motility. Surprisingly, this group of cells exhibited high FM4-64 fluorescence in the midpiece. To study this phenomenon in more detail, super-resolution techniques and algorithms were used. Among them, Super-Resolution Radial Fluctuations (SRRF) and Mean Shift Super-Resolution (MSSR) were employed. Thanks to these technologies, we found that this change in FM4-64 fluorescence is associated with a decrease in the diameter of the sperm midpiece. Previous reports have shown that intracellular calcium plays a fundamental role in AE in mice, specifically, it was seen that there is a transient increase in intracellular calcium in the head and then this ion is transported to the midpiece. For this reason, single cell experiments were carried out using Fluo4 (intracellular calcium probe) together with FM4-64 to see if the increase in calcium is coincident with the contraction of the midpiece. After induction with progesterone, it was seen that most cells showed a transient increase in calcium in the midpiece, which occurs prior to the contraction. Furthermore, the relation of the contraction with the actin double helix that accompanies the mitochondria in the midpiece was studied. To achieve this, firstly, single cell experiments were performed with FM4-64 and the F-actin probe, SiR-actin. These results demonstrate that as the midpiece contracts, the actin double helix and the membrane come closer as colocalization of both probes increases. Secondly, other super-resolution techniques were also used in fixed sperm, such as Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) to see in detail the structure of the actin double helix. It was found that with AE, the double helix changes its structure both in the magnitude of the radius and in the periodicity of the helix turns. Finally, in order to study these structural changes in the midpiece in a functional assay, in vitro fertilization and gamete fusion experiments were carried out in real time. As a result of these, it was found that the midpiece of the murine sperm exhibits a decrease in intracellular calcium followed by contraction as fusion with the oocyte progresses. In conclusion, the results of this thesis demonstrate that the midpiece of the murine flagellum undergoes structural and dynamic changes during fusion with the oocyte that may be essential for the flagellum to stop moving and fuse correctly with the female gamete.
Citación:
---------- APA ----------
Jabloñski, Martina. (2023). Análisis por microscopía de súper-resolución de los cambios en el flagelo espermático murino durante la fusión con el ovocito. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7286_Jablonski
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Jabloñski, Martina. "Análisis por microscopía de súper-resolución de los cambios en el flagelo espermático murino durante la fusión con el ovocito". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7286_Jablonski
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