Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia

Agrofoglio, Yamila Carla

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia
Título alternativo:	Molecular characterization of cotton blue atypical disease associated virus and study of cotton resistance breakdown
Autor:	Agrofoglio, Yamila Carla
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Instituto de Biotecnología CICVyA, INTA-Castelar
Publicación en la Web:	2022-03-29
Fecha de defensa:	2017-03-23
Fecha en portada:	2017
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Distéfano, Ana Julia
Consejero:	Hopp, H. Esteban
Jurado:	Bravo Almonacid, Fernando; Capiati, Daniela; Wirth, Sonia
Idioma:	Español
Palabras clave:	ENFERMEDAD AZUL ATIPICA; QUIEBRE DE RESISTENCIA; SUPRESOR DE SILENCIAMIENTO; POLEROVIRUS; CLRDVATYPICAL COTTON BLUE DISEASE; RESISTANCE BREAKDOWN; SILENCING; SUPPRESSOR; POLEROVIRUS; CLRDV
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6196_Agrofoglio
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6196_Agrofoglio.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6196_Agrofoglio
Ubicación:	Dep.BIO 006196
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Agrofoglio, Yamila Carla. (2017). Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6196_Agrofoglio

Resumen:

En las campañas algodoneras 2009-2010 en varias regiones de la provincia de Chaco se detectó una virosis en cultivares de algodón resistentes al cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), que producía leve enrollamiento de las hojas y desregulaba la dominancia apical sin afectar la altura de la planta. Se tomaron muestras de plantas de un cultivar resistente (aislamiento M3) y uno susceptible (aislamiento M5) al CLRDV que presentaban la nueva sintomatología y se realizaron ensayos de PCR con primers diagnósticos para tres familias virales que infectan algodón: Luteoviridae, Geminiviridae y Bromoviridae. Además, se usaron primers diagnóstico para la familia Potyviridae ya que son capaces de infectar a más de 200 especies vegetales. Las muestras resultaron positivas cuando se analizó al grupo taxonómico de los Luteoviridae, indicando que el virus desconocido pertenece a esta familia y descartando, en principio, una coinfección con virus conocidos. Se secuenció la región amplificada de 1065 pb y se observó alta identidad de secuencia, tanto en nucleótidos como en aminoácidos, con el CLRDV. En el presente trabajo se completó la secuenciación de ambos aislamientos y se analizó su organización genómica. Ambos genomas virales resultaron de una longitud de 5.866 nucleótidos, presentaron la organización típica de los Polerovirus y se identificaron siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Se analizaron las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de ambos aislamientos y las diferencias encontradas entre sí fueron menores al 2%, concluyendo que corresponden a una misma cepa viral. Por otro lado, las proteínas de ambos aislamientos mostraron una identidad de secuencia que variaba entre el 88% y el 98% con respecto a las correspondientes proteínas codificadas por el CLRDV. A pesar que el International Committe on Taxomy of Viruses (ICTV) establece que diferencias mayores al 10% en cualquier producto génico son suficientes para definir una nueva especie dentro del género Polerovirus, los aislamientos M3 y M5 sólo mostraron una baja identidad en la secuencia de la proteína más variable entre las especies del género (proteína P0). Por ese motivo, consideramos que ambos aislamiento corresponden a una cepa atípica del CLRDV, CLRDV-at, que produce distinta sintomatología y es capaz de quebrar la resistencia presente en el germoplasma de algodón que se siembra localmente. Se estudió el origen evolutivo del CLRDV-at con respecto a otras especies de la familia Luteoviridae. Para ello, se construyeron árboles filogenéticos utilizando las secuencias de aminoácidos de la proteína P0, supresor de silenciamiento génico, y la proteína P3, correspondiente a la cápside viral. En ambos dendogramas, los dos aislamientos de CLRDV-at se agruparon en un mismo cluster separados de los aislamientos brasileros del CLRDV y del aislamiento argentino de CLRDV. Con el objetivo de confirmar que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector Aphis gossypii, se tomó una colonia de áfidos de una planta de algodón resistente a enfermedad azul y con síntomas de CLRDV-at y se transfirieron a plantas de algodón de la variedad NuOpal (resistente a CLRDV) y al cabo de 3 semanas se observaron los primeros síntomas de la enfermedad. La presencia del virus fue analizada mediante RT-PCR y posterior secuenciación, confirmando que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector A. gossypii. Con el objetivo de caracterizar al CLRDV-at a nivel molecular y biológico se construyó un clon infectivo de cDNA del virus. El clon infectivo permitió la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector. Se infectaron distintas variedades de G. hirsutum resistentes y susceptibles a CLRDV y 3 semanas postinfección, las plantas desarrollaron hojas en las yemas laterales, las nervaduras se curvaron y las hojas adquirieron una coloración verde oscura. El RNA viral fue detectado en las hojas sistémicas mediante RT-PCR y Northern blot, confirmando la funcionalidad del clon infectivo. Dado que los síntomas no se correspondían completamente con los observados en el campo y con la premisa de que la enfermedad se manifiesta al final del ciclo del cultivo, se infectaron plantas con cuatro meses de desarrollo con el clon infectivo del CLRDV-at. Los síntomas característicos de la enfermedad a campo se observaron a las 3 semanas postinfección y la infección fue confirmada por RT-PCR. En el género Polerovirus, la proteína P0 fue inicialmente descripta como un factor de patogenicidad y recientemente fue caracterizada como supresor del silenciamiento del RNA. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del turnip yellow virus (TuYV), en la planta modelo A. thaliana, está dada por la interacción con las proteínas ASK1 y ASK2. ASK1 y ASK2 son componentes del complejo SKP1-Cullin F-Box (SCF) y pertenecen a la familia de proteínas E3 ubiquitin ligasas. Cuando se produce la interacción del complejo SCF con P0, la proteína Argonauta 1 (AGO1) de la vía del silenciamiento de la planta es ubiquitinilada y degradada por una vía dependiente de autofagia. La interacción ocurre a través del dominio F-Box (LPXXL/IX(10-13)P) que poseen las proteínas P0, y que está presente en el P0 del CLRDV, y parcialmente en CLRDV-at, donde se encuentra mutado el aminoácido Leucina (L) por el aminoácido Valina (V), perdiendo, en parte, el dominio consenso. Para analizar si la proteína P0 del CLRDV-at (P0CLR-at) posee actividad supresora de silenciamiento génico al igual que la proteína P0 del CLRDV (P0CLR), se utilizaron dos sistemas experimentales que permitieron obtener diferente información acerca del mecanismo de supresión. En el primer sistema se evaluó la capacidad de la proteína P0 de inhibir el silenciamiento génico gatillado al agroinfiltrar una segunda copia del transgén de la proteína verde fluorescente de aguaviva (GFP) en la línea 16c de N. benthamiana (expresa la proteína GFP en forma constitutiva) y en el segundo sistema, se estudió la capacidad de la proteína P0 de suprimir el silenciamiento del RNA disparado por secuencias de RNA doble cadena (dsRNA). En ambos sistemas se observó que la proteína P0CLR-at posee actividad supresora del silenciamiento local, aunque su actividad es más suave que la observada en la proteína P0CLR y al igual que esta última, no posee actividad supresora del silenciamiento sistémico. También, se demostró que la proteína P0CLR-at es capaz de interactuar con la proteína SKP y GSK (ortólogos de ASK en N. benthamiana y G. hirsutum) y esa interacción conlleva a la desestabilización de la proteína AGO1. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del TuYV (P0Tu) es menor cuando se realiza el ensayo de supresión con el clon infectivo del virus, posiblemente porque P0Tu presenta niveles muy bajos de expresión durante la infección viral. Para evaluar si P0CLR-at también posee la misma actividad supresora de silenciamiento en el contexto de la infección viral, se realizaron ensayos de coinfiltración, como los mencionados anteriormente, pero utilizando en este caso el clon infectivo de cDNA del CLRDV-at. Cabe destacar que el clon infectivo mostró una mayor actividad supresora con respecto a la observada cuando se expresa P0CLR-at sola, lo que probablemente se deba a que la proteína P0CLR-at es más estable en el contexto de la infección viral, o bien a que el virus posee otra proteína con actividad supresora del silenciamiento. También se estudió la patogenicidad de la proteína P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo, como es el sistema de PVX. Se infectaron plantas N. benthamiana y se observó que las construcciones PVX-P0CLR y PVX-P0CLR-at producían una exacerbación de los síntomas de infección con respecto al PVX wild type pero el PVX-P0CLR-at desarrollaba síntomas más suaves de infección con respecto al PVX-P0CLR. Estos ensayos nos permitieron concluir que las proteínas P0CLR-at y P0CLR no sólo poseen diferencias en su actividad supresora del silenciamiento, sino también en la severidad de los síntomas que producen. A pesar de la alta identidad de secuencia entre CLRDV y CLRDV-at, ambos virus producen distintos síntomas y el CLRDV-at es capaz de sobrepasar la resistencia a CLRDV de las variedades de algodón. Con el objetivo de identificar la(s) proteína(s) responsable(s) del quiebre de la resistencia y del cambio de la sintomatología, se reemplazaron la proteína P4, implicada en el movimiento viral de célula-célula, y la proteína P0 del CLRDV-at en forma individual en el clon infectivo del CLRDV, que estaba disponible en el laboratorio, dando a lugar a las construcciones quiméricas: 35S/CLRDV-MPCLR-at y 35S/CLRDV-P0CLR-at, respectivamente. La construcción 35S/CLRDV-MPCLR-at no fue capaz de infectar plantas de cultivares resistentes a CLRDV, mostrando que esta proteína por sí sola no logra sobrepasar la resistencia; sin embargo, se observó una disminución en la severidad de los síntomas con respecto a las plantas inoculadas con el clon infectivo del CLRDV. La construcción 35S/CLRDV-P0CLR-at logró establecer la infección en variedades de algodón resistentes al CLRDV y los síntomas observados correspondieron a los del CLRDV-at, indicando que la proteína P0 sería la responsable de sobrepasar la resistencia y del cambio de síntomas. Los resultados del presente trabajo de tesis permitieron la caracterización de una nueva variante del virus cotton leafroll dwarf virus, CLRDV-at, que causa la enfermedad azul atípica del algodón, se identificó el insecto vector y la proteína responsable del desarrollo de síntomas y el quiebre de la resistencia. Además, se construyó un clon infectivo de cDNA, que permitirá acelerar la búsqueda de germoplasma resistente en los programas de mejoramiento de algodón.

Abstract:

In the 2009-2010 growing season, an outbreak of a new disease occurred in two cotton growing regions in the province of Chaco probably because of a virus infection. The symptoms associated with the disease included slight leaf rolling and a bushy phenotype in the upper part of the plan and affected both cotton varieties, resistant or susceptible to Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV). In order to identify the etiological agent, the samples from R and S varieties were screened by RT-PCR with polerovirus primers, universal geminivirus primers, ilarvirus primers and a universal potyvirus primer. The two samples were positive only for the presence of a polerovirus. The 1,065 kb genome fragment of both isolates were sequenced and the deduced amino acid sequences were similar to CLRDV. The complete genomic sequences of two independent virus isolates associated with the new disease were obtained. The viral genome was 5,866 nucleotides long for both isolates and presented seven predicted open reading frames (ORFs) as other Polerovirus genus members. For individual ORFs, the isolates have a high level of identity in their nucleotide and aminoacid sequence, indicating that the strains isolated from both cotton varieties correspond to the same virus species. The comparison between the seven putative encoded proteins of the new isolates and the encoded protein from CLRDV displayed significant divergence in P0 protein (88.2% in M3 and 87% in M5) while keeping a high identity in the other proteins (93-100%). According to the criteria established by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), the M3 and M5 isolates could be proposed as members of a new species within the genus Polerovirus, because differences greater than 10% were observed in the P0 amino acid sequences regard to CLRDV-ARG. However, since the amino acid sequence differences in the other gene products were less than 10%, it was proposed that the two isolates represent an atypical strain of CLRDV (CLRDV-at). Phylogenetic analysis between CLRDV-at and members of the family Luteoviridae, based on P0 and P3 amino acid sequence, were performed. P3 (ORF 3) encodes the coat protein, the most conserved protein among the genus, and P0 (ORF0) encodes the most variable protein. Both trees showed that CLRDV-at isolates form a branch separated, while sharing a same cluster, with Brazilian and Argentinian CLRDV isolates. In order to evaluate if Aphis gossypii can transmit CLRDV-at, a colony of A. gossypii was obtained from a CBD-resistant cotton plant with symptoms of the new disease. The aphids were transferred to healthy young G. hirsutum cv. NuOpal (CBD-resistant) and the plants developed leaf rolling 3 weeks postinoculation. The ORF0 was amplified by RT-PCR, sequenced and analyzed. Infectious cDNA clones are an important tool to study the molecular and cellular process of RNA virus infection coupled with agroinfection has been used as an alternative to aphids for introducing virus into plants. A full-length infectious cDNA clone from CLRDV-at was developed and it was able to infect both susceptible and resistant cotton varieties. After 3 weeks, symptoms such as slight leaf rolling began to appear in systemic leaves and small leaves emerged in the lateral buds compared to the uninfected plants and no dwarf phenotype was apparent. Viral genomic RNA was detected by RT-PCR and Northern blot. In order to reproduce field-infection plants with four months of development were infected with the CLRDV-at infective clone; Characteristic symptoms of field disease were observed at 3 weeks and viral RNA was detected by RT-PCR. P0 protein from polerovirus was first proposed to be involved in viral symptom expression and it was recently characterized as suppressor of RNA silencing. The P0 protein of TuYV (P0Tu) was shown to interact through its F-box motif with the Arabidopsis S-phase kinase associated protein 1 (SKP1), orthologs ASK1 and ASK2 in Arabidopsis thaliana, which are components of the SKP1-Cullin-F-box (SCF) and correspond to the E3 ubiquitin ligases family. This interaction induce ARGONAUTE1 (AGO1) degradation, a core component of the RNA silencing pathway, by autophagy. As the interaction occurs through the F-box motif (LPXXL/IX(10-13)P), point mutations, may abolish its interaction with SKP1 and consequentially decreasing AGO destabilization and viral pathogenesis. In order to analyze whether P0CLR-at presents silencing suppressor activity in spite of the mutations in the F-box motif, two RNA silencing suppression tests were used to obtain different information about the suppression mechanism. The suppression test using the N. benthamiana line 16c, which has an integrated GFP transgene that can be silenced by infiltrating extra copies of the GFP transcript. Such induced GFP silencing can be blocked by simultaneous infiltration of a vector expressing a silencing suppressor protein. In the second test, it was studied the ability of P0 protein to suppress the silencing of RNA triggered by double stranded RNA (dsRNA) sequences. In both systems, P0CLR-at protein was capable of inhibit local RNA silencing, although its activity is weaker than P0CLR and neither present systemic silencing suppression activity. Also, it was shown that the P0CLR-at protein interacts with the SKP protein (ASK ortholog in N. benthamiana) leading to a diminution of AGO1 accumulation. P0’s start codons are in suboptimal translation initiation context in polerovirus. It has been reported that P0Tu present lower suppression activity when it is expressed in its viral context. In order to test the full length cDNA CLRDV-at suppression activity, coinfiltration assays as mentioned above were performed. Interestingly, P0CLR-at displayed stronger silencing suppression activity when it was expressed from an infectious clone. This finding suggests that it might be other factors, apart from the efficiency of translation, critical to the silencing suppression strength in the viral environment. However, the existence of another viral silencing suppressor protein cannot be exclude. To determine whether the expression of P0 can enhance the pathogenicity of another virus, the P0 coding region was inserted into the PVX-based vector. N. benthamiana plants were infected with the constructs PVX-P0CLR, PVX-P0CLR-at and PVX wild type. The chimera constructs were shown to exacerbate infection symptoms with respect to PVX wild type and PVX-P0CLR-at developed less infection symptoms compared to PVX-P0CLR. P0CLR-at and P0CLR proteins not only present different level of suppressor activity, but also in the severity of the symptoms. Despite sequence identity, CLRDV and CLRDV-at produce different symptoms and CLRDV-at is able to overcome CLRDV resistance gene of cotton varieties. In order to identify the protein(s) responsible for the breakdown of resistance and symptom develop, P4 protein, involved in cell to cell viral movement, and the P0 protein of CLRDV-at were replaced In the CLRDV infective clone, giving rise to 35S/CLRDV-MPCLR-at and 35S/CLRDV-P0CLR-at chimeric constructs, respectively. The 35S/CLRDV-MPCLR-at construct was not able to infect plants of CLRDV-resistant cultivars, showing that this protein alone cannot overcome the resistance. However, it was observed a decrease in the severity of symptoms compared to CLRDV inoculated plants. The 35S/CLRDV-P0CLR-at construct succeeded in establishing infection in CLRDV-resistant cotton varieties and the symptoms observed corresponded to CLRDV-at, indicating that P0 protein could be responsible for the resistance overcoming and the symptom change. The results of this thesis contributed to the characterization of new strain of Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV-at) which causes an atypical cotton blue disease. It was identified the insect vector and the protein responsible for symptoms development and resistance breakdown. In addition, an infectious cDNA clone was constructed which will facilitate the screening for resistance genes in cotton germplasm bank.

Citación:

---------- APA ----------

Agrofoglio, Yamila Carla. (2017). Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6196_Agrofoglio

---------- CHICAGO ----------

Agrofoglio, Yamila Carla. "Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6196_Agrofoglio

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