Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae

González Bardeci, Nicolás Diego

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae
Título alternativo:	Structure and function of the D/D domain of the regulatory subunit of protein kinase A in Saccharomyces cerevisiae
Autor:	González Bardeci, Nicolás Diego
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Química Biológica e Instituto de Química Biológica. Laboratorio de Transducción de Señales
Publicación en la Web:	2016-04-11
Fecha de defensa:	2015-03-25
Fecha en portada:	2015
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Moreno de Colonna, Silvia Margarita
Director Asistente:	Rossi, Silvia Graciela
Jurado:	Estrin, Darío A.; Wetzler, Diana E.; Ceccarelli, Eduardo A.
Idioma:	Español
Palabras clave:	PROTEINA QUINASA A; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; PROTEINAS DE ANCLAJE DE LA QUINASA A; DICROISMO CIRCULAR; DISPERSION DE RAYOS X A BAJO ANGULO; ESTRUCTURA CRISTALINAPROTEIN KINASE A; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; A-KINASE ANCHORING PROTEINS; CIRCULAR DICHROISM; SMALL-ANGLE X-RAY SCATTERING; CRYSTAL STRUCTURE
Tema:	química/química biológica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5746_GonzalezBardeci
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5746_GonzalezBardeci.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5746_GonzalezBardeci
Ubicación:	Dep.QUI 005746
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. González Bardeci, Nicolás Diego. (2015). Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5746_GonzalezBardeci

Resumen:

La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una quinasa de serina y treonina deamplio espectro que fosforila a sus proteínas blanco en respuesta a estímulosespecíficos. Se encuentra involucrada en la regulación de una gran diversidad deprocesos fisiológicos en una amplia variedad de organismos, motivo por el cual es unmiembro modelo de estudio de la superfamilia de las Proteínas Quinasa. En la mayoría de los organismos, en condiciones de baja concentración de cAMP existecomo una holoenzima inactiva heterotetramérica conformada por dos subunidadescatalíticas (C) y un dímero de subunidades regulatorias (R). En respuesta a estímulosextracelulares específicos, las concentraciones intracelulares del segundo mensajeroaumentan; como consecuencia, dos moléculas de cAMP se unen a cada subunidad R,generando un cambio conformacional que disocia la holoenzima en un dímero desubunidades R y dos subunidades C activas. En mamíferos existen cuatro isoformas de la subunidad R, que presentan una estructurade dominios bien conservada entre los distintos organismos. Ésta consiste de dosdominios de unión a cAMP hacia el extremo C-terminal, y una región responsable de ladimerización hacia el extremo N-terminal. Esta pequeña región de apenas 50aminoácidos se denomina dominio de dimerización y anclaje (D/D), ya que constituyeademás una superficie de interacción para una familia de proteínas denominadas AKAPs (A-Kinase Anchoring Proteins). Estas proteínas tienen como función proporcionar a laholoenzima de la PKA la localización subcelular necesaria para garantizar lapropagación adecuada de las señales disparadas por cAMP. Todas ellas presentan unahélice anfipática de unos 20 aminoácidos cuya cara no polar interactúa con alta afinidadcon una superficie hidrofóbica proporcionada por los dominios D/D. Se conocen las estructuras de alta resolución de los dominios D/D de mamíferos, tantoen su forma apo como en complejo con péptidos derivados de distintas AKAPs. Sinembargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios estructurales de estosdominios en otros organismos. El objetivo principal de este trabajo consiste en obtener una caracterización estructuraly funcional del dominio D/D de Bcy1, la subunidad R de la PKA de S. cerevisiae. Lamotivación principal radica en contribuir con el primer estudio de estos dominios enorganismos no mamíferos, a efectos de establecer una comparación con éstos. S.cerevisiae es un organismo modelo por excelencia en bioquímica y biología molecular, yresulta muy pertinente para este trabajo dado que en este organismo la PKA es unaenzima fundamental involucrada en la regulación de los procesos relacionados con larespuesta a la disponibilidad de nutrientes, respuesta a estrés, desarrollo y entrada enfase estacionaria. En primer lugar, se realizó un mapeo del dominio D/D de Bcy1 por análisisbioinformático de secuencias y experimentos de entrecruzamiento químico utilizandomutantes de deleción de Bcy1 en su extremo N-terminal. En segundo lugar, se procedióal clonado, sobreexpresión en bacterias, y desarrollo de un protocolo de purificación delfragmento recombinante Bcy1 1-50. Posteriormente, se procedió a su caracterizaciónestructural, para lo cual se utilizaron dos abordajes generales: estudiar la estructura ensolución y elucidar la estructura cristalina. Para la primera parte, se determinó el estado oligomérico en solución y se obtuvieronparámetros hidrodinámicos característicos utilizando cromatografía de exclusiónmolecular (SEC), dispersión estática de la luz (SLS) y dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Por otro lado, se estudió la estructura secundaria utilizando dicroísmo circular (CD). Finalmente, se construyó un modelo de la estructura en solución consistente conlos datos experimentales, mediante herramientas de modelado molecular. En segundolugar, se logró resolver la estructura cristalina utilizando difracción por rayos X (XRD). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han identificado varias proteínasinteractoras de Bcy1. Estas proteínas son consideradas “candidatas” a ser las primeras AKAPs reportadas en levaduras. Para concluir este trabajo, se estudió la interacciónentre el fragmento Bcy1 1-50 y un péptido sintético derivado de una de estas proteínas, Ira2. Para ello se utilizaron técnicas de dicroísmo circular y espectroscopía defluorescencia.

Abstract:

The cAMP dependent protein kinase (PKA) is a broad spectrum serine/threonine kinasewhich phosphorylates its target proteins in response to specific stimuli. It is involved inthe regulation of a great diversity of physiological processes in many organisms. Therefore, it is a model member of study of the Protein Kinase superfamily. In most organisms, when cAMP levels are low, it exists as an inactive heterotetramericholoenzyme which is formed by two catalytic (C) subunits and a regulatory (R) subunitdimer. In response to specific extracellular stimuli, the intracellular concentrations ofthe second messenger rise; as a consequence, two molecules of cAMP bind each Rsubunit, thus triggering a conformational change that dissociates the holoenzyme in an Rsubunit dimer and two active C subunits. In mammals there exist four isoforms of the R subunit, which present a well conserveddomain structure among many organisms. It consists of two cAMP binding sites at the Cterminus,and a region responsible for dimerization at the N-terminus. This small regionof 50 amino acids is called the dimerization and docking (D/D) domain since it presentsa surface for interaction with proteins of the AKAP (A-Kinase Anchoring Proteins)family. These proteins are responsible for the appropriate subcellular localization of theholoenzyme, which is required for the propagation of the signaling events triggered bycAMP. They all present an amphipathic helix of 20 amino acids with a non-polar facethat interacts with high affinity with a hydrophobic surface in the D/D domains. The high resolution structures of mammalian D/D domains are well known, both in theirapo forms and in the AKAP peptide complex. However, to date no structural studies ofthese domains in other organisms have been performed. The main goal of this work consists in performing a structural and functionalcharacterization of the D/D domain of Bcy1, the R subunit of PKA from S. cerevisiae. Themotivation for this work consists in contributing with the first structural study of thesedomains in non-mammalian organisms, in order to compare with mammalian features. S. cerevisiae is a prototypic organism in biochemistry and molecular biology, and it is ofgreat interest for this work because PKA is a key enzyme involved in the regulation onutrient availability, stress response, development and entry into stationary phase. As a first approach, we performed a mapping of the D/D domain of Bcy1 using sequenceanalysis and chemical crosslinking experiments with deletion mutants of the N-terminusof Bcy1. Secondly, we cloned, overexpressed, and purified a recombinant fragment, Bcy1 1-50. Finally, we proceeded with its structural characterization, which consisted of twogeneral approaches: to study the solution structure and the crystal structure. For the solution structure analysis, we determined the oligomeric state and obtainedhydrodynamic parameters using size-exclusion chromatography (SEC), static lightscattering (SLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS). On the other hand, we studiedthe secondary structure using circular dichroism (CD). Finally, we generated a model ofthe solution structure which is consistent with the experimental data, using molecularmodelling tools. Finally, we solved the crystal structure using X-ray diffraction (XRD). Recently, in our group, several proteins that interact with Bcy1 have been identified. These proteins are considered “candidates” to be the first AKAPs reported in yeast. Toconclude this work, we studied the interaction between the fragment Bcy1 1-50 and asynthetic peptide derived from one of these proteins, Ira2. To accomplish this goal, weused CD and fluorescence spectroscopy techniques.

Citación:

---------- APA ----------

González Bardeci, Nicolás Diego. (2015). Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5746_GonzalezBardeci

---------- CHICAGO ----------

González Bardeci, Nicolás Diego. "Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2015.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5746_GonzalezBardeci

Estadísticas:

Descargas totales desde :

Navegar

Colección

Tesis Doctoral