Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Desarrollo y caracterización de esferoides infectados con virus herpes para el estudio de compuestos con actividad antiviral |
| Título alternativo: | Development and characterization of herpes virus infected spheroids for the study of compounds with antiviral activity |
| Autor: | Pacheco, Gerónimo |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
|
| Fecha de defensa: | 2025-10-29 |
| Fecha en portada: | Octubre 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Barquero, Andrea Alejandra |
| Jurado: | Cordo, Sandra Myriam; Alaimo, Agustina; Carcagno, Abel Luis |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001872_Pacheco |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001872_Pacheco.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001872_Pacheco |
| Ubicación: | Dep.BIO 001872 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Pacheco, Gerónimo. (2025). Desarrollo y caracterización de esferoides infectados con virus herpes para el estudio de compuestos con actividad antiviral. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001872_Pacheco |
Resumen:
Los esferoides constituyen un modelo de cultivo 3D que aprovecha la capacidad de muchas células de agregarse formando masas cultivables in vitro. A diferencia de los cultivos 2D, donde las células crecen en monocapas adheridas a superficies, los esferoides permiten interacciones en todas las direcciones, imitando mejor la homeostasis in vivo. Estos modelos reproducen de manera más fiel procesos como diferenciación, metabolismo, resistencia a fármacos y respuesta a estímulos. Por ello, resultan más representativos de la patogénesis viral, ya que los virus suelen replicarse con mayor eficacia en cultivos 3D. El presente trabajo se enmarca en un proyecto interdisciplinario que estudia las propiedades antivirales de quimio tipos obtenidos por síntesis química, cuyo diseño novedoso se inspira en productos naturales. La necesidad de contar con un modelo de cultivo 3D para el cribado y evaluación de antivirales llevó a plantear la hipótesis que este enfoque permitiría identificar antivirales que podrían pasar inadvertidos en sistemas 2D y brindar una caracterización más precisa de los candidatos en evaluación. En este estudio se utilizaron las líneas celulares Vero, A549 y HepG2, comparando diferentes modelos de generación de esferoides: cultivo en pocillos con fondo redondo o en U, y la técnica de gota colgante en placas de 96 pocillos o en la tapa de placas de 6. Se ensayaron distintos números de células iniciales y se evaluó la formación de esferoides mediante microscopía óptica. Los pocillos en U no resultaron adecuados, mientras que ambas variantes de gota colgante fueron eficientes. El protocolo óptimo correspondió al uso de 12.500 células/gota en la tapa de placas de 6 pocillos, que generó esferoides uniformes en 7 días, con bajo costo y alta reproducibilidad. Posteriormente, se evaluó la viabilidad celular en esferoides tratados con 5-fluorouracilo o cisplatino mediante dos métodos de tinción: Azul Tripán (células muertas) y Rojo Neutro (células vivas). Si bien se pudo confirmar que ambos tratamientos provocaron la muerte de la totalidad de las células en los esferoides, las tinciones no reflejaron este efecto adecuadamente. A continuación, la susceptibilidad de los esferoides a la infección viral se estudió con una cepa recombinante de Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1 YK 608), que expresa proteínas fluorescentes. En esferoides de HepG2 y Vero la infección se observó claramente al microscopio, mientras que en A549 la fluorescencia fue menos evidente. Finalmente, se ensayaron el aciclovir (ACV) y un compuesto sintético (C102) como antivirales frente a HSV-1 en esferoides. Se evaluó la infección mediante microscopía de fluorescencia y la cuantificación del virus en el medio. Ambos compuestos redujeron significativamente la replicación viral, evidenciado por menor fluorescencia y preservación de la integridad morfológica de los esferoides tratados respecto de los controles. El análisis de producción viral mostró una reducción del 96,78% con C102 y del 99,99% con ACV, en relación con el control viral. Estos hallazgos sugieren que los compuestos analizados penetran la estructura tridimensional de los esferoides y mantienen su actividad antiviral. Por lo tanto, este trabajo valida a los esferoides como un modelo más complejo y fisiológicamente relevante que el cultivo 2D para el estudio y la selección de candidatos antivirales.
Abstract:
Spheroids are a 3D culture model that exploits the ability of many cells to aggregate into culturable masses in vitro. Unlike 2D cultures, where cells grow in surface-attached monolayers, spheroids allow for interactions in all directions, better mimicking in vivo homeostasis. These models more faithfully reproduce processes such as differentiation, metabolism, drug resistance, and response to stimuli. Therefore, they are more representative of viral pathogenesis, as viruses typically replicate more efficiently in 3D cultures. This work is part of an interdisciplinary project studying the antiviral properties of chemotypes obtained by chemical synthesis, whose novel design is inspired by natural products. The need for a 3D culture model for screening and evaluating antivirals led to the hypothesis that this approach would identify antivirals that might go undetected in 2D systems and provide a more precise characterization of the candidates under evaluation. This study used Vero, A549, and HepG2 cell lines, comparing different models of spheroid generation: culture in round- or U-bottom wells, and the hanging drop technique in 96-well plates or on the lid of 6-well plates. Different initial cell numbers were tested, and spheroid formation was evaluated by optical microscopy. U-wells were not suitable, whereas both hanging drop variants were efficient. The optimal protocol corresponded to the use of 12,500 cells/drop on the lid of 6-well plates, which generated uniform spheroids in 7 days, with low cost and high reproducibility. Subsequently, cell viability was evaluated in spheroids treated with 5-fluorouracil or cisplatin using two staining methods: Trypan Blue (dead cells) and Neutral Red (living cells). Although both treatments confirmed the death of all cells in the spheroids, the staining did not adequately reflect this effect. The susceptibility of the spheroids to viral infection was then studied using a recombinant strain of Herpes simplex virus type 1 (HSV-1 YK 608), which expresses fluorescent proteins. In HepG2 and Vero spheroids, infection was clearly observed microscopically, while fluorescence was less evident in A549. Finally, acyclovir (ACV) and a synthetic compound (C102) were tested as antivirals against HSV-1 in spheroids. Infection was assessed by fluorescence microscopy and virus quantification in the medium. Both compounds significantly reduced viral replication, as evidenced by lower fluorescence and preservation of the morphological integrity of the treated spheroids compared to controls. Viral production analysis showed a 96.78% reduction with C102 and a 99.99% reduction with ACV, relative to the viral control. These findings suggest that the tested compounds penetrate the 3D structure of the spheroids and maintain their antiviral activity. Therefore, this work validates spheroids as a more complex and physiologically relevant model than 2D culture for the study and selection of antiviral candidates.
Citación:
---------- APA ----------
Pacheco, Gerónimo. (2025). Desarrollo y caracterización de esferoides infectados con virus herpes para el estudio de compuestos con actividad antiviral. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001872_Pacheco
---------- CHICAGO ----------
Pacheco, Gerónimo. "Desarrollo y caracterización de esferoides infectados con virus herpes para el estudio de compuestos con actividad antiviral". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001872_Pacheco
Estadísticas:
Descargas mensuales
Total de descargas desde :
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001872_Pacheco.pdf
Distrubución geográfica
